組織工程支架在耳廓重建中的研究進展

劉小剛 李甜 張舵

[摘要]耳廓重建主要是為了治療先天性小耳畸形、外傷等造成的耳廓畸形或缺損，由于耳廓獨特的形態與精細的生理結構，使得耳廓重建一直都是臨床極具挑戰性的治療手段之一。自體肋軟骨移植與人工支架置入是耳廓重建的常見方法，而軟骨組織工程的出現，給耳廓重建帶來了新的發展。其中選擇合適性能的支架材料是研究熱點之一，本文擬結合國內外研究進展，對耳廓重建的三種類型、不同軟骨組織工程支架的特點以及耳廓支架面臨的挑戰與3D打印應用等內容綜述如下。

[關鍵詞]組織工程支架;耳廓重建;軟骨細胞;先天性小耳畸形;3D打印

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）02-0161-05

Research Progress of Tissue Engineering Scaffold in Auricle Reconstruction

LIU Xiaogang， LI Tian， ZHANG Duo

（Department of Plastic and Aesthetic Surgery， the First Hospital of Jilin University， Changchun 130000， Jilin， China）

Abstract： Auricle reconstruction is mainly to treat auricle deformities or defects caused by congenital microtia， trauma， etc. Due to the unique shape and fine physiological structure of the auricle， auricle reconstruction has always been a clinically challenging treatment one of the means. Autologous costal cartilage transplantation and artificial stent implantation are common methods of auricle reconstruction， and the appearance of cartilage tissue engineering has brought new developments to auricle reconstruction. Among them， choosing a suitable stent material is one of the research hotspots. This article intends to combine the progress at home and abroad to investigate the three types of auricle reconstruction， the characteristics of different cartilage tissue engineering stents， the challenges faced by the auricle stent， and the 3D printing applications summarized as follows.

Key words： tissue engineering scaffold; auricle reconstruction; chondrocytes; congenital microtia; 3D printing

耳廓重建大多是為了治療先天性小耳畸形、外傷等造成的耳廓畸形或缺損，這些疾病不僅對患者的身心健康造成極大的危害，也增加了臨床治療的挑戰性。其中，先天性小耳畸形（Microtia）是具有代表性的疾病，致病原因可能與遺傳、胚胎發育不良等相關[1]。據報道，Microtia在全世界的平均發病率為2.06/10 000[2]，在中國為3.06/10 000[3]。

自體肋軟骨移植與人工支架置入，是耳廓重建常見的方法。隨著組織工程的快速發展，軟骨組織工程逐漸成為優化耳廓重建技術的突破口。組織工程是一門結合生物醫學和材料工程學等學科的交叉學科，主要為了研究出能夠改善機體形態與功能的生物替代品。近年來，組織工程在血管、神經、骨再造等領域均有發展，同時在耳廓重建中的探索也有極大的進展，1997年，曹誼林等[4]首次報道在裸鼠體內成功培養出了具有三維結構的人耳廓形態的組織工程軟骨，這進一步激起了學者們對軟骨組織工程應用于耳廓重建的興趣。但是支架材料種類繁多，選擇合適的耳廓支架尤為重要，它不僅能為種子細胞提供新陳代謝的場所，而且也能為細胞調節因子提供結合位點，尤其是三維多孔支架的出現，為耳廓軟骨組織的形成和特異性細胞外基質的產生提供合適的環境[5]。因此，本文擬對耳廓重建的三種類型、不同軟骨組織工程支架的特點以及耳廓支架面臨的挑戰與3D打印應用等內容綜述如下。

1? 耳廓重建

1.1 自體肋軟骨移植：自體肋軟骨移植最早開始于1959年，Tanzer等[6]應用自體肋軟骨雕刻成耳支架，使耳廓形態得到了良好的塑造。在此基礎上，Brent等[7]將該術式優化成四期，重建時間縮短至3個月，術式安全可靠，但步驟較多，Nagata等[8]遂將其整合后提出二期重建的方法：①自體肋軟骨取出并雕刻置入，同時耳垂轉位;②掀起耳廓以重建顱耳角，創面游離植皮。但對于耳后皮膚少、低發際線患者效果明顯不佳，為了解決該問題，莊洪興等[9]結合皮膚擴張法，分為三期進行：①擴張器置入;②擴張器取出，同時獲取、雕刻及植入自體肋軟骨;③耳屏、耳甲腔等塑形。相比Nagata法也大大減少了耳廓支架暴露與感染的風險。自體肋軟骨通常選自右側第6～8肋，對患者年齡有一定的要求，5～6歲時耳廓可達到成人的80%～90%[10]，年齡太小肋軟骨數量不夠，因此，一般6歲后可進行手術[11]。此方法由于生物相容性良好的巨大優勢而廣泛應用于臨床，但對于術者的雕刻技術要求較高，胸廓畸形與氣胸等并發癥時有發生[12]。

1.2 人工支架置入：多孔高密度聚乙烯（商品名Medpor），是臨床上主要應用的人工支架，一種高分子復合材料，塑形性好，加熱后可切割焊接，其多孔隙有利于細胞增殖以及微血管長入，同時具有低排異性、無毒性。支架結構一般含有“Y”形耳基和“C”形耳輪兩部分，術前依據健側耳大小進行制作，之后應用帶血管蒂的顳淺筋膜瓣覆蓋Medpor支架，由于兒童的正常耳生長性，支架可適當放大。與自體肋軟骨植入相比，消除了獲取自身肋軟骨的痛苦與傷害，也降低了手術的難度，明顯縮短了手術時間[13]，同時可以不考慮肋軟骨的量與骨化問題，手術時間可以提前到患者3歲時進行，通常一期手術即可[12]。但是Medpor材料質地較硬，柔韌性差，植入后通常存在支架外露、斷裂、感染等問題[14]，為了彌補皮瓣的不足，有學者提出在患側乳突區置入皮膚擴張器，二期取出擴張器后再置入Medpor，用擴張的皮瓣覆蓋[15]。Ali等[16]提出通過顳頂筋膜瓣和全層皮膚移植，以充分覆蓋Medpor支架，來降低擠壓率和感染率，以上優化措施使并發癥發生率得以降低，通常在1%～5%[17]。

1.3 軟骨組織工程：為了獲得更適宜的耳廓重建方法，不僅生物相容性好而且損傷小。二十世紀九十年代，軟骨組織工程的出現，給耳廓重建的發展帶來了新的生機。軟骨組織工程是組織工程的一種發展方向，將種子細胞如軟骨細胞等體外培養，種植于生物相容性良好、可降解的支架材料中，最終置入形成的組織工程化軟骨以修復軟骨缺損。自曹誼林等[4]首次報道人耳廓形態的組織工程軟骨以來，軟骨組織工程應用于耳廓重建的技術得到了巨大發展。Zhou等[18]將體外培養的組織工程軟骨應用于人患耳處，使得小耳畸形患者獲得了良好的耳廓形態，這是耳廓軟骨組織工程從基礎實驗走向臨床應用的新發展。同時，邢飛等[19]提出原位組織工程，即不采用種子細胞體外培養，主要利用支架材料的理化性質來募集自體細胞至缺損部位進行修復，但是支架材料如何更好地募集細胞的問題亟待解決。總之，軟骨組織工程應用于耳廓重建仍需不斷的探索與優化，其中對于支架材料的選擇是研究的必要環節。

2? 軟骨組織工程支架

2.1 理想的支架特點：理想的軟骨組織工程支架需滿足以下特點。①具有良好的生物相容性，對種子細胞無毒性及排斥反應;②具有良好的生物可降解性甚至降解可調節性;③具有良好的表面活性，有利于細胞黏附與擴增;④具有良好的三維孔隙結構，有利于營養的運輸與代謝[20]，當孔徑和孔隙率越大機械強度越差，孔徑越小又容易堵塞，阻礙營養物質的擴散與代謝產物的排出[21]，Zopf等[22]實驗表明，球型微孔優于不規則形狀的微孔;⑤具有良好的機械強度與可塑性，耐磨損耐支撐，并能維持一定的軟骨形態長期存在，因此，力學性能應接近于正常的耳廓軟骨，而彈性模量是反應力學性能的重要指標，正常的耳廓軟骨彈性模量平均為（1.66±0.63）MPa[23-24]。近年來，新型軟骨組織工程支架不斷優化，從天然生物材料逐漸向人工合成材料以及復合材料等方向發展。

2.2 現實的支架特點

2.2.1 天然生物材料：天然生物材料是自然條件下生成的材料，具有生物相容性良好、可降解、來源廣泛和成本小等優點，但是機械強度較差、降解快。常見有膠原、明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、細菌納米纖維素以及脫細胞支架等。

膠原是細胞外基質中的重要組成部分，廣泛存在于哺乳動物的皮膚、軟骨、肌腱和韌帶等結締組織中，具有支撐、保護的作用。載入膠原支架的耳廓軟骨細胞在體外培養2周后移植到體內可發現軟骨樣組織[25]。之后，Cohen等[26]將細胞-支架復合物植入裸鼠體內長達6個月，仍可見到軟骨樣組織的存在，說明膠原支架具備一定的長期穩定性。將骨髓間充質干細胞（BMSC）放在軟骨細胞生長過的培養基中進行誘導培養，再結合膠原支架，同樣證實了此改良方法的成功性[27]。明膠是將膠原部分水解得到的一類可降解的、生物相容性良好的材料，當明膠海綿支架結合超過100 μg/cm3的堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）時，在促進b-FGF緩慢釋放的同時有助于組織工程耳廓軟骨的形成[28]。海藻酸鹽是比較常用的軟骨組織工程天然支架材料，無毒害作用，主要是從海藻中提取，與鈣離子接觸即可形成水凝膠。盡管海藻酸鹽具有良好的生物相容性與多孔結構，但是在體內降解不穩定，后來，Leslie等[29]通過加入海藻酸鹽裂解酶，得到可降解、可注射的海藻酸鹽水凝膠。將種子細胞換成脂肪干細胞，結合海藻酸鹽微球在兔耳缺損模型中也能證實軟骨樣組織的形成[30]。殼聚糖是自然界中廣泛存在的幾丁質通過脫乙酰化得到的，與軟骨細胞外基質糖胺聚糖有相似的結構，具備較好的生物相容性和可降解性，但單純應用機械強度及韌性差，多與其他材料復合使用。細菌納米纖維素（BNC）是一種由幾種細菌共同作用產生的多糖，類似于三維膠原網絡，具有多孔性，孔徑為70～140 nm，易結合水成水凝膠，還具有較高的機械強度、結晶度，其中含17%BNC的水凝膠，力學強度和耳廓軟骨相似，異物反應小，但制備較復雜需去除內毒素[31]。脫細胞支架是通過去除組織中的細胞成分得到的細胞外基質，生物相容性良好并且可降解。軟骨脫細胞支架[32]，具有類似軟骨細胞外基質的結構和分子完整性，甚至基質的超微結構也能得到保留，并且具有促進軟骨形成的潛力。彈性軟骨細胞在體外培養可能會失去形成彈性纖維的能力，而通過去細胞化制備出天然的耳廓軟骨脫細胞支架，可以保留彈性纖維，并且發現在該支架上培養的BMSC能夠向軟骨分化[33]。研究表明，在不添加外源性生長因子的情況下，使用自體甚至異體BMSC來源的脫細胞支架，都能在體外促進BMSC向軟骨細胞分化[33-34]。與人工合成的長效可注射材料相比，脫細胞支架異物反應較少，可作為另一種長期可注射的填充材料[35]。為了進一步提高材料的耐用性，Lin等[36]研究出小腸黏膜下層脫細胞支架，除了用于血管、肌腱和膀胱等組織再生的研究外，當載入脂肪干細胞體內培養12個月，可形成血管化的類似耳廓的軟骨樣組織。

2.2.2 人工合成材料：人工合成材料是天然材料經過人為的物理化學等方法加工制得的高分子聚合物。具備良好的可塑性和機械強度，并且生產重復性好。但這些聚合物在生物學上通常是惰性的[32]，生物相容性普遍不如天然生物支架，降解后的酸性產物，也會改變細胞增殖分化的微環境[37]。目前，常見的人工合成材料有高密度聚乙烯（ Medpor）、聚己內酯 （poly-caprolactone，PCL）、聚羥基乙酸（ poly-glycolic acid，PGA）等。

聚乙烯按抗拉強度分低、高、超高三個不同等級，高密度聚乙烯Medpor作為一種無機疏水材料，主要用于面部整形手術。Medpor具有良好的生物相容性、耐久性、可塑性和不可再吸收性，孔徑為40～200 μm[12]，孔隙率約50%，單獨作為人工支架置入時，廣泛應用于耳再造。但是材質偏硬，楊氏彈性模量為227～307 MPa，遠大于正常耳廓軟骨的機械性能[38]，因此容易出現支架外露等并發癥。另外，Medpor也可用作模型，結合纖維蛋白凝膠及耳廓軟骨細胞，置入體內能夠形成人耳廓形狀的軟骨樣組織。PCL是一種生物可吸收類型的聚合物，結合3D打印技術可構建成耳廓形狀[39-40]。Nakao等[41]將小耳畸形患者的殘耳軟骨細胞和納米級PGA支架結合在一起，發現在裸鼠皮下存活時間可長達40周，并且生成的新軟骨特征與正常耳廓軟骨細胞來源的組織工程軟骨非常相似。劉戈等[42]將人耳廓軟骨與聚氨酯彈性體、Medpor進行力學性能比較，發現和Medpor相比，聚氨酯彈性體壓縮彈性與軟骨接近，是更為理想的人工耳支架材料，這對耳廓重建的術后安全性更為有利。

2.2.3 復合材料：復合材料是由兩種或兩種以上的物質以不同的形式、比例組合而成的材料，不僅能保持各自的優良性能，而且能通過互補獲得單一材料不能達到的綜合性能。尤其是人工合成材料與天然生物材料結合后，可以增加自身生物學功能，同時提高后者的機械性能[32]。

蠶絲-海藻酸鹽復合支架，Sterodimas等[43]將耳軟骨膜間充質干細胞與該復合支架共培養置入體內，發現復合物的形態大小、靈活性甚至組織成分與正常耳廓軟骨相似，類似的天然生物材料之間的結合材料還有膠原蛋白-纖維蛋白混合凝膠[44]等。當耳廓軟骨細胞結合纖維蛋白水凝膠覆蓋在改良的耳狀Medpor上，進行體內培養發現有軟骨樣組織形成，并且與對照組相比，未見明顯感染及支架外露[45]。殼聚糖-聚乙烯醇-環氧氯乙烷混合水凝膠，在促進細胞生長和細胞外基質形成的同時，還具有良好的力學性能和生物學特性[46]。蠶絲-聚乙烯醇，是由50%的蠶絲和50%的聚乙烯醇（PVA）復合而成的水凝膠，具有較好的生物相容性和機械強度，置入大鼠體內6周后仍可見三維耳狀的軟骨樣組織[47]，同樣類型還有10%生物玻璃/聚合羥丁酸鹽-羥戊酸酯[48]。對于海藻酸鹽-聚己內酯復合材料[21]，該材料由外模PCL和內部海藻酸水凝膠組成，具有良好的力學性能及仿生環境，基于3D打印技術的PCL外模，孔徑為300 μm，易于打印組裝與降解吸收。Matzenauer等[22，49]將內部水凝膠換成透明質酸-膠原，在不使用外源性生長因子的情況下，將比例為5：1或10：1的脂肪干細胞和耳廓軟骨細胞共培養后，置入體內也可見到組織工程軟骨的形成[39]。脫細胞-海藻酸鹽-聚乙烯醇-甲基丙烯酰復合材料，海藻酸鹽和聚乙烯醇是一種具有生物相容性和生物降解性的聚合物，目前常用作組織工程的水凝膠支架[50]，結合脫細胞后利用細胞外基質可得到一種生物相容性與力學性能均良好的復合材料[32]。當脫細胞與甲基丙烯酸軟骨素硫酸鹽結合后，發現該復合材料具有良好的靈活性，并且可以通過調整水凝膠、脫細胞、種子細胞類型和播種密度促進耳廓軟骨細胞的生長[51]。聚羥基乙酸-聚乳酸（PGA-PLA）復合支架，研究表明PGA比起PLA更適合細胞的黏附和增殖，但降解速度較快，兩者結合后性能得到提高，體內置入載有耳廓軟骨細胞的PGA/PLA復合支架，可見軟骨樣組織形成[52-53]，尤其是添加20%的PLA時更為顯著[54]。

3? 耳廓支架面臨的挑戰與3D打印應用

3.1 面臨的挑戰：面對不斷更新的耳廓軟骨組織工程支架，雖然在體內外實驗中均能發揮重要的作用，不僅有組織工程化軟骨形成，而且具有良好的耳廓形態與生物相容性，但是如何在種類繁多的支架材料中選擇最為適合的耳廓支架，以下問題值得進一步研究：①如何協調好耳廓支架降解與軟骨細胞擴增的關系，是對機械強度與生物相容性共同的考驗;②軟骨組織工程支架設計的主要原則是模擬細胞外基質的成分與結構特點[55]，需要從軟骨細胞外基質的角度去評估與構建，未來納米復合材料可能會成為新的研究方向;③選擇合適的種子細胞與細胞因子，對于整個軟骨組織工程系統來說同樣重要，目前三種類型各有研究，統一的、持續性的實驗研究或許能產生更大的進步;④絕大多數支架材料應用于小動物實驗，例如置入到裸鼠背部皮下，這與臨床埋置于乳突前緊張的皮膚下相距甚遠，因此，合適的實驗模型是驗證支架能否具有合適機械強度的前提，這對后期應用于臨床試驗十分重要。

3.2 3D打印應用：耳廓重建是一種美學實踐，需要個性化、立體化的設計，利用3D打印技術是近年來熱門且高效的方式。隨著以計算機輔助設計/計算機輔助制造（CAD/CAM）技術為代表的數字化技術的發展，三維掃描獲取健側耳廓參數可以形成數字化耳模，結合3D打印技術后，能夠生產出高保真、復雜幾何形狀的解剖支架，應用于術前建模指導手術或者制作個性化外耳假體[56-57]。有學者模仿3D 打印耳模雕刻肋軟骨[58]，形成了具有個性化的耳支架，這極大地提高了耳再造的術后效果，并縮短了手術時間。近年來，許多學者將3D打印的耳支架應用于軟骨組織工程進行耳廓重建，Kajsa等[59]利用海藻酸納米纖維素生物墨水對人軟骨細胞進行三維生物打印用于軟骨組織工程，并提出基于納米纖維素的生物墨水是一種適用于活細胞3D生物打印的水凝膠。另外，3D耳支架能精細地控制微孔結構，為支架材料的塑形提供有力的技術支持，比如構建具有微型纖維結構的Ⅰ型膠原支架[53]以及常見的多孔隙PCL耳外模[22，49]。在優化支架材料的孔隙性以及力學性能的同時，也能對支架的結構進行調整，Lee等[40]通過構建兩種不同類型水凝膠的PCL支架，可以得到耳廓軟骨和不含軟骨的耳垂這兩種結構。He等[60]提出了一種熔斷電流體的3D打印技術，通過調節移動速度和方向，可以打印出具有彎曲性和預定纖維方向或間距的多層三維PCL支架，這極大地促進了細胞的體外增殖和排列。Mannoor等[61]通過3D打印技術，結合生物細胞和電子納米顆粒，打印出同時具有耳廓結構和聲音傳導功能的仿生耳，體現了單純的耳廓外形重建已逐漸發展到兼具形態與功能的耳再造。

4? 小結和展望

支架材料的發展是優化軟骨組織工程的關鍵，給包括治療先天性小耳畸形在內的耳廓重建帶來了新選擇，其中復合材料是耳廓軟骨組織工程支架的研究主流，與3D打印技術結合后能夠塑造出更加精確的耳廓外形。支架材料種類繁多，現有的研究多針對新型支架的研發，缺乏一套規范的評估標準，望引起更多學者的關注，盡管支架材料在耳廓重建中的研究和應用還面臨著諸多挑戰，但隨著軟骨組織工程技術的深入發展，有望結合3D打印技術獲得可行的支架材料，并早日應用于臨床造福于患者。

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[收稿日期]2020-05-06

本文引用格式：劉小剛，李甜，張舵.組織工程支架在耳廓重建中的研究進展[J].中國美容醫學，2022，31（2）：161-166.

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