GABRA3突變通過抑制TGF-β1/SMAD2信號通路調控神經元的凋亡、突觸形成和遞質釋放

付倫姣，羅成宏，楊媚，陸偉恒，廖成鉅

(東莞市松山湖中心醫院 神經內科，廣東 東莞 523326)

甲亢性低鉀周期性麻痹(thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis,THPP)是以突發、復發及可逆發作的肌肉無力為特征的一種甲亢疾病，占甲亢患者的3%～6.8%[1]。統計發現亞洲THPP的發病率較高，男性為最主要發病人群。然而到目前為止THPP的發病機制仍不明確[2]。鈣通道α3亞基基因(calcium channel α3 subunit gene,GABRA3)為氯通道蛋白家族成員，編碼GABA受體α3亞單位。該基因高度表達于神經細胞和神經肌肉接頭處[3]，此前研究發現GABRA3 參與調控腫瘤的轉移[4-5]、動物的行為及情緒反應[6]，并被發現與先兆子癇、癲癇、腦病及畸形特征相關[3,7]。值得注意的是一項基于泰國人群的全基因組關聯性分析發現，GABRA3基因2個單核苷酸多態性(SNP)位點(rs12688628 與rs750841)基因多態性與THPP有關[8]。肌無力是THHP 的重要癥狀。有研究表明GABRA3表達于腦部和骨骼肌的多個位點[6,9-10]，有可能參與調節THHP的肌無力癥狀，其基因位點突變有可能影響神經肌肉接頭處遞質的傳遞[11]，從而導致乏力的發生。提示GABRA3基因突變可能與 THPP 的發病有關，然而GABRA3基因突變對神經元生長、凋亡、突觸形成、遞質釋放等的作用及其機制并不清楚。

因此，本研究探討GABRA3突變對神經元細胞突觸形成、凋亡水平及神經遞質乙酰膽堿釋放的影響，初步獲得GABRA3突變對神經元細胞突觸形成、凋亡水平及神經遞質乙酰膽堿釋放的影響的潛在機制，為GABRA3突變的臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦皮層神經元細胞(CP-H120)購于武漢普諾賽生物科技有限公司；胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)和杜氏改良培養液(DMEM)/F12培養基購于美國Gibco公司；四唑化合物(MTS)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1/信號轉導蛋白Sma-Mad族2(Sma-Mad2,SMAD2)信號通路的激活劑SRI-011381購于美國MedChemExpress公司；蛋白質提取試劑盒購于德國Novagen公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)購于美國默克Sigma-Aldrich公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)、Bax、TGF-β1、SMAD2、磷酸化的SMAD2(P-SMAD2)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和突觸蛋白I(Synapsin I)第一抗體以及IgG-HRP偶連的抗體第二抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。電化學發光(ECL)檢測試劑購于美國GE Healthcare Bio-Sciences公司。DeadEndTM比色末端脫氧核苷酸轉移酶末端標記(TUNEL)系統(G7130)購于美國Promega公司。Alexa Fluor 594偶聯的二抗和二脒基苯基吲哚(diamino-2-phenyl indole,DAPI)均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購于德國BD Biosciences公司。酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定試劑盒購于美國Invitrogen eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 人腦皮層神經元培養 將CP-H120人腦皮層神經元細胞置于6孔板2 ml DMEM/F12培養基，培養基中添加10%FBS，培養條件為含5%的CO2及37 ℃的培養箱，收集細胞對數生長期的細胞(1×106ml-1)進行后續處理。

1.2.2 GABRA3突變型和野生型人腦皮層神經元構建以及細胞的給藥和分組 本實驗對CP-H120人腦皮層神經元進行基因突變型的構建，合成野生型GABRA3(wt-GABRA3組)、突變型GABRA3(mut-GABRA3組)、質粒(General Biosystems,Inc)。其次，為研究突變對人腦皮層神經元的影響，在轉染前將細胞以5×105ml-1的密度接種到6孔板中并培養24 h。根據制造商的說明，使用lipofectin3000將wt-GABRA3、mut-GABRA3、質粒轉染到含細胞的孔中轉染48 h。

1.2.3 四唑化合物(MTS)測定法檢測細胞增殖 wt-GABRA3組和mut-GABRA3組細胞分別接種在96 孔板中(2.0×104孔-1)，培養48 h后通過MTS測定法測定細胞增殖。將MTS溶液(20 μl)添加到板子的每個孔中，然后將培養板在37 ℃下孵育 1 h，并讀取450 nm處 的吸光度值。

1.2.4 TUNEL檢測神經元細胞凋亡 神經元細胞的凋亡水平檢測采用 TUNEL法。wt-GABRA3組和mut-GABRA3組細胞制作切片后，根據制造商的說明使用DeadEndTM 比色 TUNEL系統。用DAPI對細胞核進行復染，利用Image-Pro Plus 軟件檢測每個細胞切片的變化，凋亡細胞確定為每組5個不同視野區域的測量值。在此條件下，正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈熒光綠，凋亡指數通過凋亡細胞數與細胞總數比值計算。

1.2.5 流式細胞術分析神經元細胞凋亡 wt-GABRA3組和mut-GABRA3組細胞分別接種在96 孔板中(2.0×104孔-1)并培養24 h，根據制造商的說明使用 Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。細胞在冰上用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯的Annexin V 和碘化丙啶(5 mg·ml-1)染色30 min，然后通過流式細胞術(BD Biosciences)進行檢測，使用FlowJo 9.1軟件分析數據。

1.2.6 蛋白質印跡法 使用蛋白質提取試劑盒獲取wt-GABRA3組和mut-GABRA3組的細胞總蛋白。通過Bensadoun等[12]的方法對蛋白質進行定量，細胞蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜與caspase3(1∶500)、Bax(1∶500)、TGF-β1(1∶400)、SMAD2(1∶800)、P-SMAD2(1∶600)、GAPDH(1∶2 000)一抗和辣根過氧化物酶偶聯的二抗連續孵育后使用ECL檢測試劑觀察免疫印跡，對檢測到的條帶進行定量。

1.2.7 細胞免疫熒光 wt-GABRA3組和mut-GABRA3組細胞被4%聚四氟乙烯固定10 min,并使用0.1% Triton x-100在PBS中通透 10 min。室溫下切片用10%的正常山羊血清封閉1 h，進一步于4 ℃用Synapsin I一抗孵育過夜。細胞與Alexa Fluor 594偶聯的二抗孵育1 h。載玻片最后經過DAPI染色后封裝于抗熒光淬滅試劑中,使用奧林巴斯熒光顯微鏡采集熒光圖像。

1.2.8 神經元細胞突觸數的測量 以目的神經元胞體中心為圓心，兩倍胞體長度為半徑作圓，計算圓內 Synapsin I 染色陽性的數目，表示單個細胞形成的突觸數目。

1.2.9 乙酰膽堿的ELISA檢測 根據乙酰膽堿ELISA測定試劑盒提供的說明檢測wt-GABRA3組和mut-GABRA3組細胞培養上清液中乙酰膽堿的水平，在酶標儀中于450 nm處讀取吸光度值。

1.3 統計學處理

所有結果使用3次以上獨立實驗的均數±標準差表示，兩組數據采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 GABRA3突變對人腦皮層神經元細胞增殖的影響

為驗證該推測，本實驗構建慢病毒介導的GABRA3突變型和野生型質粒，將wt-GABRA3和mut-GABRA3慢病毒質粒導入細胞內，并檢測GABRA3突變對細胞增殖率的影響。mut-GABRA3組細胞的相對細胞增殖率為(59.19±2.12)%,明顯低于wt-GABRA3組的(92.32±4.22)%，差異有統計學意義(t=16.334，P=0.009)。

2.2 GABRA3突變對人腦皮層神經元細胞凋亡的影響

利用TUNEL法檢測神經元細胞的凋亡變化發現，mut-GABRA3組細胞的凋亡強度明顯高于wt-GABRA3組，見圖1A。我們繼續使用流式細胞術檢測GABRA3突變對細胞凋亡率的影響，mut-GABRA3組細胞的相對細胞凋亡率為(35.12±4.55)%,明顯高于wt-GABRA3組的(4.21±0.43)%，差異有統計學意義(t=17.211，P=0.004),見圖1B。

A.TUNEL法檢測人腦皮層神經元的凋亡(× 400)，標尺=50 μm；B.流式細胞術檢測凋亡細胞的比例圖1 GABRA3突變對人腦皮層神經元凋亡的影響A.TUNEL assay was used to detect the apoptosis of neurons in human cortex(×400),with a scale of 50 μm;B.The proportion of apoptotic cells was measured by flow cytometryFig 1 Effects of GABRA3 mutation on apoptosis of human cortical neurons

使用蛋白質印跡法檢測發現，mut-GABRA3組細胞中caspase3和Bax的相對水平(4.25±0.43、5.03±0.52)明顯高于wt-GABRA3組(1.00±0.04、1.00±0.02)，差異均有統計學意義(t值分別為19.112、19.822；P值分別為0.002、0.001)(圖2)。

與wt-GABRA3組比，*P<0.05圖2 GABRA3突變對人腦皮層神經元凋亡標志物的影響*P<0.05 vs. wt-GABRA3Fig 2 Effects of GABRA3 mutation on apoptotic markers of human cortical neurons

2.3 GABRA3突變對人腦皮層神經元細胞突觸形成的影響

利用免疫熒光法檢測神經元細胞的突觸形成蛋白Synapsin I發現，mut-GABRA3組細胞軸突的相對熒光強度(0.37±0.05)明顯低于wt-GABRA3組(0.57±0.04)，差異有統計學意義(t=16.223，P=0.005)(圖3)。mut-GABRA3組細胞突觸密度為(13.33±1.12)%，明顯低于wt-GABRA3組的(78.23±2.15)%，差異有統計學意義(t=23.234，P=0.001)(圖3)。

細胞免疫熒光法觀察mut-GABRA3組中 Synapsin I的表達變化圖3 GABRA3突變對神經元細胞突觸密度及突觸蛋白表達的影響(×400)The expression of Synapsin I in mut-GABRA3 group was observed by cellular immunofluorescence methodFig 3 Effects of GABRA3 mutation on synaptic density and synaptic protein expression in neurons(×400)

2.4 GABRA3突變對人腦皮層神經元遞質釋放的影響

進一步使用ELISA法研究GABRA3突變對神經元乙酰膽堿釋放的影響，mut-GABRA3組的乙酰膽堿相對水平(0.56±0.07)明顯低于wt-GABRA3組(1.00±0.03)，差異有統計學意義(t=17.289，P=0.002),見圖4。

與wt-GABRA3組比，*P<0.05圖4 GABRA3突變調節乙酰膽堿*P<0.05 vs. wt-GABRA3Fig 4 GABRA3 mutations regulate acetylcholine

2.5 GABRA3突變通過抑制TGF- β1/SMAD2信號通路調控神經元的凋亡、突觸形成和遞質釋放

經過蛋白質印跡法檢測，我們發現mut-GABRA3組的TGF-β1和p-SMAD2蛋白明顯低于wt-GABRA3組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖5。

我們在mut-GABRA3組細胞中加入TGF-β1/SMAD2激活劑SRI-011381，結果顯示神經元的凋亡率明顯下調(圖6A、B)，caspase3和Bax水平明顯降低(圖6C)，而且突觸密度明顯增加(圖6D)，神經遞質乙酰膽堿的水平(0.89±0.12)明顯高于mut-GABRA3組(0.56±0.07)，差異有統計學意義(t=14.677，P=0.006)。

與wt-GABRA3組比，*P<0.05圖5 GABRA3突變對人腦皮層神經元TGF-β1/SMAD2信號通路蛋白表達的影響*P<0.05 vs.wt-GABRA3Fig 5 Effects of GABRA3 mutation on protein expression of TGF-β1/SMAD2 signaling pathway in human cortical neurons

3 討 論

THPP疾病基因的遺傳變異與THPP相關的功能意義仍不清楚。目前，人們已經觀察到遺傳易感性在THPP中起作用，與THPP相關的SNP研究主要集中在CACNA1S、SCN4A、KCNE3 3個通道基因，分別為編碼骨骼肌Ca2+通道、Na+通道和K+通道的基因[13]。有研究[8]發現，GABRA3的3號內含子的SNPs與THPP密切相關。

前期本實驗室研究發現，中國南方漢族人群THPP患者(n=35)的GABRA3基因3號內含子rs12688628位點G等位基因型在THPP 組的突變頻率升高，而且rs12688628位點G/T多態性與THPP 發病具有顯著相關性，表明GABRA3基因可能為THPP的易感基因之一。因此，本研究進一步探討了GABRA3對神經元凋亡和突觸形成的調節作用和機制，我們的研究結果表明，GABRA3突變可以調節神經元的凋亡和突觸形成。GABRA3是γ-氨基丁酸A型受體的一個亞基，多個此類亞基組成氯離子通道[14]。目前已在多種腫瘤研究中證實GABRA3蛋白過表達能促進細胞增殖，GABRA3在腫瘤中易受到微小RNA的調節，從而改變其表達，并促進三陰性乳腺癌[15]和胰腺癌[16]細胞的增殖。目前盡管缺乏GABRA3對神經元細胞增殖影響的研究，但也有研究表明，配體GABA可以刺激正常神經元細胞增殖[17]。本研究構建慢病毒介導的神經元GABRA3野生及突變細胞株，發現相比于wt-GABRA3組神經元，mut-GABRA3的神經元細胞增殖能力減弱，并且突觸密度急劇下降。目前仍缺乏關于GABRA3突變調控神經元細胞增殖和突觸密度降低機制的解釋。

續圖

與mut-GABRA3組比，*P<0.05A.TUNEL法檢測人腦皮層神經元的凋亡(×400)，標尺=50 μm；B.流式細胞術檢測凋亡細胞的比例；C.蛋白質印跡法檢測人腦皮層神經元中caspase3和Bax的表達水平；D.突觸形成密度的統計圖圖6 GABRA3突變通過抑制TGF-β1/SMAD2信號通路調控神經元的凋亡、突觸形成和遞質釋放*P<0.05 vs.mut-GABRA3A.TUNEL assay was used to detect the apoptosis of human cortical neurons(×400),with a scale of 50 μm;B.The proportion of apoptotic cells was measured by flow cytometry;C.The expression levels of caspase3 and Bax in human cortical neurons were detected by Western blot;D.Statistical graph of synaptic formation densityFig 6 GABRA3 mutation regulates neuronal apoptosis,synaptic formation and transmitter release by inhibiting TGF-β1/Smad2 signaling pathway

神經類固醇是神經系統響應細胞應激所產生的內源性調節劑，是神經遞質系統[18]的有效調節劑。其中GABA(A)受體(GABA-A receptor,GABRs)的強增強劑四氫孕酮就被多項研究證明可保護視網膜使其損傷減輕[19-21]。而當使用特定的GABR拮抗劑后四氫孕酮的神經保護作用被抑制，說明GABR信號可介導神經的保護。神經元凋亡是神經突觸損傷的一個關鍵特征[22]。在本研究中我們通過TUNEL實驗和流式細胞術均觀察到神經元中突變的GABRA3可以明顯增加神經元的凋亡，而且增加細胞中Caspase3和Bax的表達，另外神經遞質乙酰膽堿的水平明顯降低，這表明GABRA3突變可能通過促進細胞凋亡并抑制神經遞質釋放從而抑制神經元突觸的生長。

TGF-β1廣泛表達于中樞神經系統[23]。已有研究顯示TGF-β1/SMAD2信號通路對調節神經元細胞的存活具有重要作用，且對神經遞質乙酰膽堿的活性具有增強作用，而且TGF-β1分子也是突觸形成所必需的關鍵分子，能調節神經肌肉接頭的功能[24]。因此我們推測，TGF-β1通路有可能參與維持細胞外基質結構穩定性、調節突觸形成和神經元細胞活性以及乙酰膽堿的釋放。另外已有研究[4]證實，通過GABRA3激活Akt通路從而促進乳腺癌細胞的增殖，而且Akt也是TGF-β1的一個關鍵下游途徑，因此我們深入研究了GABRA3突變神經元中TGF-β1/SMAD2信號途徑的作用，結果證實TGF-β1/SMAD2 信號通路被突變的GABRA3所抑制，而當我們使用TGF-β1/SMAD2信號激活劑SRI-011381時，神經元細胞的凋亡率明顯降低，乙酰膽堿的釋放以及突觸密度也有顯著的增加。以上結果均表明，GABRA3突變通過抑制TGF-β1/SMAD2信號通路促進神經元的凋亡，并抑制突觸形成和遞質釋放。

綜上所述，基于以上實驗結果及分析，我們提出GABRA3基因多態性與THHP 的發病有關；GABRA3 基因突變會顯著影響GABRA3在神經元細胞中的生物學功能，其中主要是調節神經元細胞的突觸形成。同時還證實了GABRA3突變抑制TGF-β1/SMAD2通路，從而促進神經元凋亡并抑制神經元細胞突觸形成。