細胞薄片組織工程及其臨床轉化的研究進展

俞杭，王經琳，2，任昊楨，2，施曉雷，2

(1.南京中醫藥大學 中西醫結合鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210046；2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 普外科，江蘇 南京 210008)

1 細胞薄片組織工程

組織工程的概念是由Vacanti等提出[1]。在醫學方面，組織工程的目的是在生長因子存在的情況下將可生物降解的支架與細胞結合起來，期望細胞和組織作為藥物直接治療疾病。已有研究表明一些人類器官組織的構建已取得了成功，如在老鼠背上構建人耳以及心臟瓣膜[2]、角膜[3]、骨[4]和軟骨[5]等組織。有研究人員提出的“細胞薄片組織工程”[6]是一種無支架的細胞薄片組織工程技術，該技術可以避免支架材料和胰酶帶來的不良影響以及獲取過程中對細胞的損害。相比于細胞懸液的直接輸注，細胞薄片可以直接覆蓋在靶器官或組織上，這極大地提高了細胞療法的治療效果。獲得的細胞薄片也可通過組織工程技術進一步疊加組裝形成3D結構，即高細胞密度、功能化的組織。細胞薄片組織工程已在人類多個器官進行臨床應用，包括心臟[7]、角膜[8]、食道[9]、牙周[10-11]、軟骨[12]以及肝臟[13]。

2 細胞薄片的制備和性質

2.1 細胞薄片的制備和收獲

由于培養的細胞通常通過內源性黏附蛋白(細胞外基質和細胞膜受體)堅固地附著在細胞培養皿上，因此必須去除這些黏附蛋白才能從培養皿表面獲取細胞。一般使用化學分離法和物理分離法兩種方法來分離貼壁細胞?；瘜W分離法即在培養皿中加入蛋白水解酶來消化細胞，使之脫落。但一般的非特異性酶消化后會沉積在細胞膜以及培養皿表面，這種不受控制的蛋白水解會損害多種重要的細胞功能，例如細胞增殖、黏附、存活和遷移。由于使用該方法最終得到的是單細胞懸液，所以其中組織形成和植入所需的內源性細胞之間的聯合都已被破壞。這種方法的缺點是當在體內注射懸浮細胞時，由于黏附蛋白的破壞阻止了細胞與宿主組織的結合并降低了細胞的整體活性[14-15]，因此酶處理后的細胞會被排除在靶部位，極大地降低了療效。另外還有使用乙二胺四乙酸(EDTA)作為螯合劑去除整合素和細胞結合蛋白中的鈣離子來釋放細胞[16]，這種方法不需要外源性的酶作用，但卻存在EDTA細胞毒性[17]。而物理分離法即是采用一種“支架”技術，該技術能為細胞生長提供一個特定的環境，并且細胞的原有結構不會被破壞，但該技術仍存在一些限制，如細胞向支架內遷移不足，細胞和營養物質對支架的滲透性較差。此外，支架的降解會引起炎癥，對支架植入后在體內的穩定性有所影響[18-19]。

針對這些問題，有研究人員提出了一種制備、收獲和移植細胞薄片的無支架組織工程，即所謂的“細胞薄片組織工程”[20]，它是將培養的細胞制備成細胞薄片的形式，通過把細胞薄片移植到受損組織或器官上來達到治療效果。該技術利用了微小的溫度變化來獲取培養的細胞，而且無需蛋白水解酶的處理，不會發生細胞或蛋白質的破壞。這種細胞薄片技術需要使用獨特的細胞培養皿，即用溫度敏感型聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)的薄層敷在聚苯乙烯培養皿上[21-22]，覆蓋后的培養皿稱為溫度敏感型細胞培養皿(TRCD)。PIPAAm的臨界溶液溫度為32 ℃，制備細胞薄片時只需將細胞在37 ℃條件下在TRCD上培養，當把環境溫度降至32 ℃以下時(一般為20 ℃)，TRCD表面的PIPAAm聚合物會迅速從疏水變為親水，水介質在低于32 ℃的溫度下自發滲透到黏附細胞和TRCD之間的PIPAAm聚合物界面，在水合作用下PIPAAm快速水化并溶脹，將細胞表面與TRCD表面分開。采用這種方法無需任何酶處理即可在TRCD上獲得貼壁的培養細胞，而且是連續完整的活細胞薄片。這種細胞薄片技術是一種溫和、無干擾的采集細胞的獨特方法，能夠從TRCD中采集貼壁細胞，而不會損害細胞外基質、細胞表面蛋白、細胞受體以及對細胞生存和功能至關重要的細胞間蛋白。

2.2 細胞薄片組織工程細胞的活性與表征

細胞療法的關鍵是細胞進入人體后所具有的活性，這關系到其發揮治療作用的強弱。Nagamoto等[23]在24孔板中培養誘導多能干細胞(iPSCs)誘導的人肝細胞樣細胞，2 d后收獲的細胞薄片大約有8×105個細胞，且經過HE染色以及驗證特征性標志物表達等實驗證實，收獲的細胞薄片在細胞活性以及特征標志物的表達上都與普通細胞培養皿上培養的細胞相似，即使在溫度降低到27 ℃時收獲的細胞薄片，也并不影響其活性與特征性標志物的表達。這表明細胞薄片在細胞回收率以及細胞活性和性能等方面都滿足了細胞療法的需要。Forghani等[24]對人體脂肪來源干細胞(hASCs)所形成的細胞薄片進行細胞形態、存活率、增殖和分化潛力的評估，結果顯示hASCs細胞薄片在達到80%～90%匯合度之前仍在增殖。獲取細胞薄片后將其重新接種在常規細胞培養皿上，hASCs依舊能黏附并增殖。研究人員通過檢測hASCs細胞薄片的成骨能力來證明其分化潛力，結果發現在培養的第14天，hASCs細胞薄片中骨鈣素的表達相較于普通培養皿培養的hASCs明顯增加。同樣，茜素紅染色發現hASCs細胞薄片中鈣的沉積也呈明顯增高趨勢。有研究人員構建了人角質細胞-成纖維細胞細胞薄片[25]，在細胞活性和增殖性能方面都予以了證明，并通過HE以及Vimintin染色證實了收獲的細胞薄片中相關細胞標志物的存在，即細胞薄片具有單純細胞所具有的表征。以上結果表明細胞薄片作為新興的細胞移植療法是可行的，結合其對于靶器官強大的定植效果，細胞薄片相較于懸浮細胞療法更具優勢。

3 細胞薄片的應用

細胞薄片組織工程的優勢在人體細胞移植的臨床研究中已得到證實，TRCD的使用使我們能夠在保留重要的細胞間連接和相關的細胞外基質的情況下獲得治療性細胞[26]。保存下來的細胞外基質起到了類似“膠水”的作用，將細胞膜與宿主細胞緊密地結合在一起。因此，細胞移植可以在不使用人工支架或縫合等額外治療的情況下完成。有了這些優點，人類對基于細胞薄片的組織再生的臨床研究又近了一步。

3.1 基于細胞薄片的肝臟組織工程

由于供肝短缺嚴重制約了原位肝移植的發展，因此肝再生療法已成為治療肝病的一種新的有前景的治療方法，由此發現了通過將新鮮收獲的肝細胞注射到脾臟或門靜脈內來研究使用肝細胞的細胞療法[27]。在一項研究[28]中，從表達人α1抗胰蛋白酶(hA1AT)的轉基因小鼠中分離出肝細胞，將肝組織片移植到帶血管的小鼠皮下組織并且通過肝門靜脈注射肝細胞懸液，比較兩種方法的體內細胞存活率以及小鼠血清中hA1AT水平，以測量移植細胞的活性。結果發現，肝細胞薄片組中移植細胞分泌的蛋白質濃度顯著高于細胞懸液注射組。這表明細胞薄片技術可以有效地將治療細胞定位于具有針對肝臟再生的靶向組織，而且通過TRCD培育出來的肝細胞薄片包含有保持肝臟特異性功能的結構，如橋粒、縫隙連接和膽小管。此外，來自于人骨髓間充質干細胞或iPSCs的肝細胞樣細胞也可被制造成細胞薄片[23,29]。由于活組織由多種細胞類型組成，細胞間的相互作用影響和維持生理功能和活動的發展，特別是在正常培養條件下，內皮細胞為肝細胞提供合適的環境，由此可以通過一種共培養技術將內皮細胞與肝細胞共同培養以在體外支持肝細胞的功能。通過這些技術，可移植的組織工程肝臟會成為治療肝病的另一種選擇。

3.2 基于細胞薄片的心臟組織工程

成肌細胞膜可以用于治療嚴重的心臟病，因為移植的細胞膜結構提供了旁分泌效應，這種旁分泌效應可以持續且局部地傳遞到受損組織。另外，一些研究集中在構建組織工程心臟作為再生醫學或組織模型中的可移植心臟，以發現治療心臟疾病的藥物[30]。在細胞薄片技術的幫助下，細胞膜之間能快速建立縫隙連接以及多個細胞膜的脈動同步[31]。有研究將細胞薄片結構移植到梗死的大鼠心臟上，心肌細胞通過橋接從移植物遷移到宿主心臟上，并且顯示了形態和功能上的聯系[30]。顯然，與直接細胞注射相比，心肌細胞薄片移植顯示出更好的細胞存活率和植入性。

將多個細胞薄片疊加可以產生3D心肌組織，但是在長期的體外培養中會發現嚴重的壞死。所以為了大規模的生產細胞薄片結構，需要讓這些組織血管化以提供足夠的氧氣和營養[32]。通常情況下受者的血管侵入移植組織后，氧氣和營養物質被輸送到組織內，然而移植的組織往往在新生血管形成前就已壞死。因此有研究發現把移植組織與內皮細胞(ECs)共培養是一種促進血管形成的很有前途的方法，該方法是將ECs夾在兩個細胞薄片之間來形成一個多層細胞薄片結構，ECs可以在這個結構中形成血管樣分支網絡，這就促進了移植后血管化以及移植后組織與宿主血管的連接[33]。

3.3 角膜細胞薄片組織工程

角膜疾病是全球第5大致盲原因，此類疾病中的大多數都可以通過角膜移植來治愈，但可移植的角膜數量限制了這個方法。最初用于眼表重建的組織工程學方法是使用羊膜[34]或纖維蛋白凝膠，但由于羊膜和纖維蛋白凝膠都是生物材料，不能排除感染的風險，并且術后羊膜的存在會降低透明度，影響患者恢復視力，因此已很少使用。為了提供可移植角膜的替代品，可以通過組織工程技術生產的活體角膜替代物在細胞表型和組織結構方面取得一些進展，旨在模仿體內的角膜替代物。已有研究描述了使用未轉化的人角膜上皮細胞生產三維組織工程化角膜的方法[3]，在TRCD上降溫收獲細胞薄片后可以直接放置在宿主角膜基質上，不需要縫合就能快速黏附[35]，培養出的細胞薄片顯示出適當的組織學以及細胞外基質(ECM)成分和整合素的表達。移植后，細胞薄片可以覆蓋整個角膜而且表面清晰光滑。有研究進一步提出了用自體口腔黏膜上皮細胞作為重建角膜表面的細胞來源[36]，在TRCD上培養的口腔黏膜上皮更接近于天然角膜上皮而不是天然口腔黏膜上皮，在人類患者身上進行移植的結果也表明喪失的視力已經恢復，角膜透明性保持了1年以上[36]。由于細胞薄片的構成僅為細胞與ECM[33]，并不含有其它異體材料，所以細胞薄片并不屬于生物材料范疇，在細胞薄片培養與收獲的過程中接觸的PIPAAm也具有良好的生物相容性[37]，結合以上優勢，細胞薄片植入體內后不會有感染的風險。利用人體自身細胞所形成的細胞薄片，更是排除了異體排斥反應的可能性。

3.4 內鏡黏膜下剝離術(ESD)治療后食管重建

ESD切除淺表食管腫瘤正變得越來越普遍，然而大規模的食管ESD通常需要隨后的多次球囊擴張來預防術后食管狹窄，因此有研究提出使用內鏡下組織工程化自體口腔黏膜上皮細胞片移植預防ESD后食管狹窄的形成，即將黏膜上皮細胞移植到ESD導致的潰瘍創面上[38]。細胞薄片可以很容易地黏附到移植部位，無需縫合或使用其他黏合劑，而且自體口腔黏膜上皮細胞薄片移植可以促進切除區域的上皮化以及防止食管狹窄。另外，移植的細胞薄片除了具有旁分泌作用外，還可以作為細胞來源促進組織再生。已有臨床研究[39]顯示,移植細胞薄片后食管潰瘍部位早期再上皮化并且食管狹窄情況減少。

3.5 牙周膜再生

牙周韌帶(PDL)作為連接牙齒和牙槽骨的支撐組織起著重要的作用，PDL來源的細胞在骨誘導培養基中具有誘導牙骨質形成的能力，因此從PDL中獲取的細胞具有再生牙周組織和牙骨質的能力。在犬類模型中，PDL細胞薄片促進了牙槽骨和牙骨質的再生[10]。在一項人類臨床研究中，從智齒中獲得PDL細胞，通過降低溫度至20 ℃可以收獲用TRCD培養的PDL細胞薄片，為了提供大量的細胞，通常在骨下缺損附近植入3層細胞薄片，細胞薄片療法在牙周膜再生方面的安全性和有效性已在9例病例中得到證實[40]。

3.6 用于腎臟再生的細胞薄片組織工程技術

已有研究[41]報道人類肝細胞生長因子(HGF)轉基因間皮細胞片作為大鼠腎纖維化模型治療單側輸尿管梗阻(UUO)的方法，將使用分泌HGF的細胞薄片的治療效果與非轉基因間皮細胞片和HGF靜脈內給藥(對照組)進行了比較，與對照組相比，在UUO大鼠中，分泌HGF的細胞層顯著抑制了腎纖維化，這就支持了細胞薄片在傳遞分泌HGF的細胞以及使細胞在植入組織局部后持續地分泌HGF抑制腎纖維化方面的價值。此外，研究人員[42]在體外將能夠分泌重要的HGF和VEGF的大鼠骨髓間充質干細胞(BMSC)片直接移植到大鼠腎臟缺血再灌注模型的腎臟表面，將使用BMSC片的治療效果與靜脈注射懸浮的BMSC進行了比較，結果發現移植細胞以BMSC細胞薄片的形式輸送比靜脈注射懸浮細胞的保留時間更長，并且BMSC細胞薄片保護了整個腎臟的微血管密度，抑制了腎功能障礙。

4 組織工程細胞薄片在臨床研究中存在的問題

4.1 種子細胞的選擇

作為一種新興的細胞療法，選擇合適的種子細胞是細胞薄片組織工程的前提。為了避免異體細胞導致的排斥反應應盡量采取自體細胞，且獲取該細胞對人體創傷較小，比如通過口腔黏膜上皮細胞活檢獲取的種子細胞[43]。近年來隨著對干細胞的研究越來越深入，也為選擇種子細胞提供了新的參考和方向。iPSCs作為干細胞技術的一種，與經典的胚胎干細胞和體細胞核移植技術不同，iPSCs技術不使用胚胎細胞或卵細胞，因此不會涉及到倫理問題。此外，利用iPSCs技術可以用病人自己的體細胞制備專有的干細胞，從而大大降低了免疫排斥反應發生的可能性。Nagamoto等[23]利用iPSCs來源的肝細胞薄片治療急性肝衰竭小鼠，Mandai等[44]利用iPSCs誘導的視網膜細胞來治療黃斑變性。

4.2 組織血管化的形成

如何建立功能化的血管通道仍是細胞薄片組織工程面臨的一個關鍵問題[45]，大部分正常組織中，由于氧氣和其他營養元素在組織中被動擴散所能達到的極限大約在100 μm，因此細胞與毛細血管的距離都在100 μm以內，而細胞薄片雖然能制造出多層三維結構組織，但仍不能擺脫這一限制。Sakai等[46]通過將肝細胞和成纖維細胞共培養獲得肝細胞/成纖維細胞細胞薄片，將該細胞薄片移植入小鼠皮下獲得血管化皮下人肝組織。Shimizu等[47]通過多次手術來解決這個限制，首先移植3層細胞薄片進入目標組織，間隔1 d使原部位的毛細血管生長入細胞薄片結構內，接著再植入3層細胞薄片于原移植部位上并重復該步驟，以此獲得了1 mm厚度且具有新生毛細血管網的三維細胞薄片組織。因此，如何構建具有血管功能性的細胞薄片仍是細胞薄片工程在臨床應用上的一個難點。

4.3 細胞薄片的力學性能

目前已能構建具有一定功能與結構的細胞薄片，但在薄片強度方面仍存在不足，在重建一些較高強度的器官如骨、血管和筋膜等仍受到限制。為解決這一限制，Ayala等[48]通過將人間充質干細胞細胞薄片與可在人體內降解的藻酸鹽凝膠相結合植入全層腹壁缺損大鼠體內，8周后發現大鼠疝氣的復發得到了阻止，并且形成了新的組織和血管網絡。因此，對于增加細胞薄片的強度和力學性能的方法還需要進一步發掘和優化。

4.4 細胞薄片的制備到臨床應用

基于細胞薄片的臨床應用目前已取得巨大進展，細胞薄片在多種疾病的治療中均有顯著的療效。細胞薄片從制備到應用最關鍵的一步即為TRCD的構建，為了實現細胞薄片在臨床治療中的廣泛應用，應大規模構建TRCD，但納米級的接枝厚度在便于細胞薄片收獲的同時也限制了TRCD的構建。因此，細胞薄片的大規模制備是臨床治療應用中一個亟需解決的問題。

5 總結與展望

細胞薄片組織工程技術在再生醫學和組織建模上與目前臨床常用的細胞療法相比，已有其獨特的特征和優勢(表1)。納米級的PIPAAm為培養底物提供了熱響應特性，這就可以通過溫度來調節細胞的黏附和分離。重要的是，這些細胞薄片可以保留完整的細胞間連接和相關的ECM?；谶@些性質，細胞薄片療法可以將各種治療細胞輸送到受損部位，并已在一些人類臨床研究中應用。除了已有的人類臨床研究，細胞薄片技術的進步有望再拓寬再生醫學的應用領域，并且使我們能夠生產出用于治療難治性疾病的人類細胞組織模型。因此，細胞薄片組織工程良好的應用前景值得期待。

表1 3種療法情況介紹