組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數預測非小細胞肺癌患者肺葉切除術治療預后的研究

杜亮，金澄宇

(新疆維吾爾自治區人民醫院 胸外科，新疆 烏魯木齊 830001)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中占比高達85%以上，以腺癌為主要組織學類型[1]。目前肺葉切除術在NSCLC早中期治療中被廣泛應用，療效確切。而相關研究報道，早中期NSCLC患者仍有一定預后不良風險，可能與腫瘤異質性、腫瘤大小等多方面因素有關[2]。而目前臨床尚無有效預測手段，不利于術后治療方案的制定。研究[3]指出，能譜CT作為一種新技術可有效評估癌組織特征，被作為術前診斷鑒別手段，可反映患者病情及預測預后不良風險。微小RNA(microRNA，miR)參與腫瘤基因表達調控，其中miR-25-3p被證實在肺癌組織中呈異常高表達，可能與患者生存情況有關[4]。推測組織中miR-25-3p水平、能譜CT定量參數可作為NSCLC患者預后預測的輔助手段，但目前相關研究報道較少?；诖耍狙芯窟M一步觀察組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數預測NSCLC患者肺葉切除術治療預后的效能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取我院2017年1月至2019年1月收治的116例NSCLC患者作為研究對象，年齡50～68歲，平均(58.12±6.30)歲；男67例，女49例；組織學分型：腺癌79例，鱗癌25例，腺鱗癌12例；分化程度：低分化5例，中分化32例，高分化79例；TNM分期[5]：Ⅰ期98例，Ⅱ期18例。我院醫學倫理委員會批準本研究，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①符合NSCLC診斷標準[6]，經術前穿刺活檢確診；②均為初次發?。虎鄯戏稳~切除術治療的適應證：周圍性肺癌或局限于肺葉內的不可逆病變；④可耐受能譜CT檢查，且患者病灶實性部分足夠測量。(2)排除標準：①入組前接受過化療或免疫治療的患者；②患有感染性疾病的患者；③一側肺部病變，對側肺功能也不全的患者；④凝血功能異常的患者；⑤麻醉耐受性差者。

1.3 方法

1.3.1 收集資料 記錄患者年齡、性別、組織學分型、分化程度、飲酒史、吸煙史、高脂血癥史、糖尿病史、高血壓史、淋巴結轉移情況、TNM分期、病灶最大直徑，其中組織學分型、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期、病灶最大直徑以手術病理學檢查結果進行評估。

1.3.2 組織中miR-25-3p水平 檢測試劑盒及試劑均由南京凱基生物技術發展有限公司提供。于治療前檢測組織中miR-25-3p水平，行穿刺活檢，取腫瘤中外1/3交接處癌組織標本，避免鈣化或壞死部分，存儲于-80 ℃冰箱中。用裂解液將凍存標本研磨成勻漿狀，使用RNA提取試劑盒提取組織RNA，采用美國Thermo公司紫外分光光度計評估RNA純度和濃度。應用逆轉錄試劑盒行逆轉錄反應，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應體系總體積20 μl，引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAA-3′，獲得cDNA。采用ABI 7500 Fast Star定量PCR儀檢測miR-25-3p表達水平，反應條件為:95 ℃ 90 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s,共40個循環。上游引物(5′-3′)為GGAATGTTGCTCGGTGA，下游引物(5′-3′)為CAGTGCGTGTCGTGGA。以U6為內參：上游引物(5′-3′)為CGCTTCGGCAGCACATA，下游引物(5′-3′)為TTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCt計算miR-25-3p相對表達量。

1.3.3 能譜CT定量參數 應用美國GE公司寶石能譜CT(Discovery CT750 HD)行胸部平掃及雙期增強掃描，患者取仰臥位，掃描參數：管電壓為高、低能量(80 kVp 與140 kVp)瞬時(0.5 ms)切換，自動毫安，螺距1.375∶1，層間距5.0，層厚5.0 mm，矩陣512×512，準直64×0.625 mm，機架旋轉時間0.6 s，掃描范圍包括肺尖至肋膈角水平。行平掃后經肘正中靜脈輸注非離子型對比劑碘海醇1.6 ml·kg-1，時間≤30 s，監測胸主動脈CT值，到達150 HU閾值后延遲5.7 s開始掃描，獲得動脈期圖像后延遲30 s獲得靜脈期圖像。將所得圖像上傳至GE AW4.6工作站，由2名主治醫師完成閱片。選取病灶實性成分作為感興趣區(region of interest，ROI)，各期ROI在相鄰3個層面上各測量1次，大小、形態及位置保持一致，取平均值。記錄平掃有效原子序數(effective atomic number，Eff-Z)，計算病灶處動、靜脈期標準化碘濃度(normalized iodine concentrations，NIC)，NIC=病灶ROI內碘含量/主動脈碘含量。

1.3.4 預后評估 患者均行肺葉切除術治療，對術前穿刺活檢顯示有淋巴結轉移的患者行術中淋巴結清掃術治療，手術均順利實施，術后復查CT證實病灶切除干凈。隨訪并指導患者到院復查，采用CT檢查評估患者復發情況，以復發為終點事件，根據復發情況將患者分為預后不良組與預后良好組，比較兩組基線資料、組織中miR-25-3p水平及能譜CT定量參數，分析組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數對NSCLC患者肺葉切除術治療預后的預測效能。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 NSCLC患者復發情況

隨訪19～24個月，平均隨訪時間(20.68±3.59)個月。116例NSCLC患者中有20例復發，復發率為17.24%；經KM法繪制復發曲線顯示，20例復發NSCLC患者中位復發時間為18個月(95%置信區間：15.809～20.191個月)。見圖1。

圖1 NSCLC患者復發Kaplan-Meier曲線Fig 1 Kaplan-Meier curve of recurrence in patients with NSCLC

2.2 預后不良組與預后良好組基線資料、miR- 25- 3p及能譜CT定量參數比較

兩組淋巴結轉移、TNM分期占比比較，差異有統計學意義(P<0.05)；預后不良組miR-25-3p相對表達量高于預后良好組，平掃Eff-Z、靜脈期及動脈期NIC低于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組年齡、性別、組織學分型、分化程度、飲酒史、吸煙史、高血脂史、糖尿病史、高血壓史、病灶最大直徑比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 預后不良組與預后良好組基線資料、miR-25-3p及能譜CT定量參數比較Tab 1 Comparison of baseline data,miR-25-3p and energy spectrum CT quantitative parameters between poor prognosis group and good prognosis group

2.3 NSCLC患者肺葉切除術治療預后影響因素的Cox回歸分析

將患者預后作為因變量(1=預后不良，0=預后良好)，將淋巴結轉移、TNM分期、miR-25-3p相對表達量、平掃Eff-Z、靜脈期及動脈期NIC作為自變量，對自變量進行賦值(表2)。經Cox回歸分析結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、miR-25-3p相對表達量、平掃Eff-Z、靜脈期及動脈期NIC是NSCLC患者肺葉切除術治療預后的影響因素(P<0.05)，見表3。

表2 自變量說明與賦值情況Tab 2 Description and assignment of independent variables

表3 NSCLC患者肺葉切除術治療預后影響因素的Cox回歸分析結果Tab 3 Cox regression analysis results of influencing factors of prognosis of patients with NSCLC treated by pulmonary lobectomy

2.4 組織中miR- 25- 3p水平聯合能譜CT定量參數預測預后的價值

將患者預后作為狀態變量(1=預后不良，0=預后良好)，將miR-25-3p相對表達量、平掃Eff-Z、動脈期NIC、靜脈期NIC作為檢驗變量，繪制ROC(圖2)，結果顯示，組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數用于預測患者預后的AUC為0.880，有一定預測價值。ROC相關參數詳見表4。

表4 組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數預測預后的ROC參數Tab 4 ROC parameters of miR-25-3p level in tissues combined with quantitative parameters of energy spectrum CT in predicting prognosis

圖2 組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數預測預后的ROC曲線圖Fig 2 ROC curve of miR-25-3p level in tissues combined with quantitative parameters of energy spectrum CT in predicting prognosis

3 討 論

因影像學診斷技術的進步，NSCLC早中期診斷率提高，利于患者及早實施治療。但NSCLC發病機制復雜，涉及到遺傳、環境多種因素的相互作用，患者術后復發轉移機制復雜，預后尚難以有效預測[7]。

大量研究[8-9]指出，早期NSCLC患者仍有一定預后不良風險，患者多項病理特征與患者預后不良密切相關。本研究結果顯示，116例NSCLC患者復發率為17.24%，中位復發時間為18個月，說明NSCLC患者術后短期預后不良風險高，與上述研究結論一致。初步比較預后不良組與預后良好組基線資料、miR-25-3p及能譜CT定量參數后，經Cox回歸分析結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、miR-25-3p相對表達量、平掃Eff-Z、靜脈期及動脈期NIC是NSCLC患者肺葉切除術治療預后的影響因素，其中淋巴結轉移、TNM分期是既往臨床用于預測腫瘤預后的常用手段。趙裕歡等[10]研究證實，NSCLC患者淋巴結轉移可增加預后不良風險，盡管部分患者為淋巴結微轉移，也可增加術后復發轉移風險，影響患者生存率。TNM分期可綜合反映腫瘤原發病灶、侵襲及轉移情況，進而反映腫瘤異質性，與患者病情進展及預后均有關[11]。因此，淋巴結轉移、TNM分期對預測NSCLC患者預后有一定價值。而僅通過淋巴結轉移、TNM分期評估NSCLC患者預后尚有局限，特異度和靈敏度尚不理想。

miR作為調節基因表達與細胞信號通路的非編碼小分子RNA，可通過促進腫瘤血管生成、調控抑癌基因表達等多種機制參與腫瘤進展，已被作為腫瘤預后的有效預測手段[12]。miR-25-3p是其中一種，可靶向調節神經源性基因Notch同源蛋白1，而神經源性基因Notch同源蛋白1可調節細胞發育、增殖、分化及凋亡[13]。miR-25-3p在NSCLC中作為致癌因子，在miR-25-3p表達上調時Notch信號紊亂，Notch同源蛋白1表達上調，癌細胞易發生生長、侵襲和轉移，患者預后不良風險高[14]。miR-25-3p還可靶向調控B細胞易位基因2，促使腫瘤進展，進一步增強腫瘤惡性生物學行為[15]。此外，相關研究[16]還指出，miR-25-3p表達上調可反饋為NSCLC患者腫瘤分化程度低、惡性程度高、轉移風險高，因此與NSCLC患者預后不良密切相關。但本研究未能對miR-25-3p與腫瘤分化程度及轉移情況的相關性進行分析，未來還應進行進一步探討。能譜CT以單源瞬時kVp切換技術為基礎，可得到連續單能量圖像，并行能譜重建，可進一步獲取多種定量參數[17]。平掃Eff-Z、靜脈期及動脈期NIC可用于鑒別病灶性質，三者低可反映腫瘤生長、侵襲能力強，新生血管無法滿足腫瘤供血需求，且腫瘤內部有較多的黏液、壞死成分，并有微出血發生，病灶表現為血供不足，進一步反映了腫瘤惡性程度高，患者預后不良風險高[18-19]。

進一步繪制ROC，結果顯示，組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數用于預測患者預后的AUC>0.85，有一定預測價值。說明組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數對NSCLC患者肺葉切除術治療預后有一定預測效能。聯合預測可彌補單項預測的不足之處，從不同方面反映患者不良預后風險，獲得理想的特異度和靈敏度。臨床可將miR-25-3p作為NSCLC患者的新治療靶點，并可對術前預測為高預后不良風險的患者實施輔助放化療治療。而因本研究未能觀察NSCLC患者細胞免疫、體液免疫功能及血清腫瘤標志物水平，結論尚有局限，未來還應納入NSCLC患者的多項資料，進一步分析NSCLC患者肺葉切除術治療預后的有效預測指標，為臨床治療提供參考意見。

綜上所述，組織中miR-25-3p水平聯合能譜CT定量參數對NSCLC患者肺葉切除術治療預后有一定預測效能，可根據術前檢測結果對患者實施針對性治療。