異常表達的PVT1作為診斷標志物預測重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒臨床結局的研究

張敏，鄭貴蘭

(曹縣人民醫院 普兒科，山東 菏澤 274400)

肺炎(pneumonia)是指發生在肺泡、肺間質及終末氣道的炎癥反應，多由病原微生物、理化因素以及藥物所致[1]。根據疾病的輕重程度，肺炎又分為輕癥肺炎與重癥肺炎[2]。前者癥狀輕微、預后良好；后者的病情往往是復雜多變，且常常伴隨著呼吸衰竭，如治療不當或不及時，則病死率極高，是感染性疾病中最常見的死亡原因之一[3]。兒童的免疫系統尚未發育完善，因而肺炎成為兒科疾病中常見的一種呼吸道疾病，并且一年四季均可發病。目前，臨床上對兒童重癥肺炎合并呼吸衰竭的治療主要采用抗感染治療和輔助通氣治療，但即便如此，仍有部分兒童因治療不當或者漏診而死亡[4]。因此，尋找有診斷價值的生物標志物對于疾病的診斷而言是極為有意義的。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄長度超過200個核苷酸的非編碼序列[5]。近年來，隨著DNA測序技術的不斷發展，人們發現lncRNA在個體的生長發育、疾病的發生發展以及神經科學等領域發揮了重要作用。LncRNA已被證實參與疾病的調控，而某些lncRNA也被證實與肺炎有關[6]。Zhou等[7]的研究顯示，lncRNA SNHG16通過與趨化因子CCL5競爭結合miR-146a-5p，進而介導JNK信號通路和NF-κB信號通路調控脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的WI-38細胞(人胚肺細胞)炎癥損傷，為肺炎的診斷和治療提供了新的思路。Chen等[8]的研究證實，lncRNA RP11-248E9.5和RP11-456D7.1對兒童肺炎有較高的診斷價值。LncRNA PVT1位于染色體8q24[9]，作為一種重要的致癌基因，PVT1已被證實在肺癌、肝癌、乳腺癌等實體癌癥中異常表達[10-12]。研究[13]表明，PVT1在膿毒癥大鼠的心肌組織中表達上調，并通過促進炎癥因子的分泌加速抑制心功能。PVT1在LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應中表達增加，并與IL-1β的表達呈正相關，PVT1通過活化肺成纖維細胞促進肺纖維化[14]?；谝陨涎芯浚覀兺茰yPVT1可能在肺炎中發揮一定的作用。因此，本研究試圖通過實驗驗證PVT1在重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒血清中的表達情況，并進一步評估PVT1對該病的診斷及預后價值。

1 資料與方法

1.1 研究人群和樣本采集

本研究共招募82例來本院就診并確診為重癥肺炎合并呼吸衰竭的患兒(疾病組)。納入標準：(1)滿足美國兒科感染性疾病學會/美國感染性疾病學會(IDS/IDSA)重癥肺炎診斷指南的臨床診斷標準[15]；(2)滿足呼吸疾病中呼吸衰竭的診斷標準；(3)呼吸衰竭僅由重癥肺炎誘發所致，患兒可接受機械通氣治療。排除標準：(1)患有其他的器官或系統感染的患兒；(2)嚴重肝腎功能不全的患兒；(3)患有免疫系統疾病的患兒；(4)惡性腫瘤患兒。另選取來本院進行體檢的健康兒童作為健康對照組。本研究遵循《赫爾辛基宣言》中關于人體研究的倫理原則，并已得到曹縣人民醫院倫理委員會的批準。本方案招募的所有受試兒童的監護人均已簽署書面知情同意書。在獲得知情同意后，對納入到本研究的所有兒童進行一般臨床資料的采集及匯總，包括性別、年齡、體質量指數等。采集所有受試者的外周靜脈血于抗凝管中，檢測白細胞計數、紅細胞沉降率、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數等指標；血液離心后收集上層血清置于-80 ℃保存，備用。

1.2 RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT- PCR)

根據TRIzol(Invitrogen，美國)的說明書上的方法及步驟進行總RNA的提取，然后使用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒(Invitrogen，美國)將RNA反轉錄成cDNA。使用miScript SYBR?Green PCR試劑盒(Qiagen GmbH，德國)和SYBR green I Master Mix 試劑盒(Invitrogen,USA)在qRT-PCR系統(Applied Biosystems，美國)上進行擴增，以GAPDH和U6作為內參并以2-ΔΔCt法對PVT1及miR-16-5p的相對表達量進行計算。

1.3 隨訪方案及內容

通過為期28 d隨訪調查記錄在隨訪時間內患兒發生死亡事件的情況，并在隨訪結束后繪制患兒發生不良事件的生存曲線，評估PVT1的表達水平與預后之間的關系。

1.4 熒光素酶報告基因實驗

使用StarBase V 2.0在線程序進行靶基因預測，發現miR-16-5p與人類PVT1基因轉錄本的3′-UTR區具有互補結合位點，隨后通過雙熒光素酶報告基因實驗對此進行驗證。首先，將PVT1的3′-UTR序列片段克隆到psiCHECK-2熒光素酶報告基因載體中，構建野生型(wild-type)報告載體PVT1-3′-UTR和突變型(mutant-type)報告載體PVT1-3′-UTR。將A549細胞以1×105個·孔-1的密度接種于24孔板中并培養過夜，直至每孔細胞密度達到60%以上。隨后根據產品說明書，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)分別將上述載體和miR-NC、inhibitor NC、miR-16-5p mimic或miR-16-5p inhibitor共轉染細胞。轉染48 h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告系統(Promega，美國)測定各組熒光素酶活性。海腎熒光素酶作為對照基因。

1.5 統計學處理

本研究采用SPSS 21.0(SPSS，美國)和GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software，美國)進行數據分析。符合正態分布的數據均以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，分類變量間比較采用卡方檢驗；ROC曲線評估PVT1、miR-16-5p在重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒中的診斷價值；Pearson相關系數分析連續變量之間的相關性；Kaplan-Meier曲線及Log-rank法檢驗PVT1對患兒不良預后的預測價值。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 人口及臨床資料

受試者的一般資料及臨床數據見表1。兩組受試者在性別、年齡、體質量指數、白細胞計數等指標上差異無統計學意義(P>0.05)，而疾病組的中性粒細胞、C反應蛋白、乳酸脫氫酶、淋巴細胞及降鈣素原水平均顯著高于健康對照組(P<0.001)。

表1 兩組間人口統計學和臨床特征Tab 1 Demographic and clinical characteristics between two groups

2.2 疾病組血清PVT1、miR- 16- 5p的表達水平及二者相關性分析

采用qRT-PCR技術對疾病組與健康對照組受試者的血清PVT1和miR-16-5p水平進行檢測，結果發現，與健康對照組相比較，疾病組患兒血清PVT1的水平顯著升高(P<0.001，圖1A)，而miR-16-5p的水平則明顯降低(P<0.001，圖1B)。疾病組與健康對照組的PVT1和miR-16-5p的差異表達說明在重癥肺炎合并呼吸衰竭的過程中PVT1和miR-16-5p可能發揮了重要的調控作用。另外，Pearson相關分析證實，疾病組患兒血清miR-16-5p水平與PVT1水平呈顯著負相關性(r=-0.734 3，P<0.000 1，圖1C)。

2.3 PVT1與臨床指標的相關性

本研究采用Pearson相關系數法評估PVT1與患兒各項臨床病理特征的相關性。結果顯示，PVT1的表達水平與患兒的中性粒細胞、C反應蛋白、淋巴細胞以及降鈣素原的水平呈現顯著的正相關性(P<0.05，表2)，表明PVT1的水平與患兒的疾病嚴重程度有關。

表2 PVT1與各項指標的相關性Tab 2 Correlation between PVT1 and various indicators

2.4 血清PVT1及miR- 16- 5p的診斷價值分析

在本研究中，我們采用ROC曲線評估了PVT1、miR-16-5p以及二者聯合對疾病的診斷意義。結果見圖2A～C，PVT1、miR-16-5p以及二者聯合的ROC曲線具有相近并且較高的AUC值、敏感度和特異度，對疾病診斷具有較高的臨床價值。以上結果表明單獨PVT1和單獨miR-16-5p均具有區分患兒和健康人群的能力，二者聯合并未觀察到診斷價值提高或者降低的現象。

A.兩組血清PVT1的相對表達量(***P<0.001)；B.兩組血清miR-16-5p的相對表達量(***P<0.001)；C.Pearson相關系數分析疾病組患兒血清PVT1與miR-16-5p的相關性圖1 PVT1、miR-16-5p的表達水平及相關性分析A.Relative expression of PVT1 in serum of two groups(***P<0.001);B.Relative expression level of miR-16-5p in serum of two groups(***P<0.001);C.The correlation between the expression level of miR-185-5p and PVT1 in disease groupFig 1 Expression level and correlation analysis of PVT1 and miR-16-5p

2.5 PVT1對重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒不良預后的預測價值

本研究根據疾病組所有患兒血清PVT1的平均表達水平，將患兒分為PVT1高表達組(n=47)和PVT1低表達組(n=35)，并根據患兒在28 d隨訪期間內發生死亡事件的情況繪制Kaplan-Meier生存曲線，通過分析PVT1的表達與患兒發生死亡事件的關系，評估PVT1對兒童重癥肺炎合并呼吸衰竭的預后價值。實驗結果表明，PVT1高表達組患兒出現死亡事件的概率顯著高于PVT1低表達組(Log-rankP=0.014，圖3)。

A.LncRNA PVT1的ROC曲線；B.miR-16-5p的ROC曲線；C.LncRNA PVT1和miR-16-5p的ROC曲線圖2 PVT1、miR-16-5p及二者聯合對疾病的診斷價值分析A.ROC curve of LncRNA PVT1;B.ROC curve of miR-16-5p;C.ROC curve of LncRNA PVT1 plus miR-16-5pFig 2 Diagnostic value analysis of PVT1,miR-16-5p and their combination for disease

圖3 不同PVT1表達水平的患兒Kaplan-Meier生存曲線分析Fig 3 Kaplan-Meier survival curve analysis of pediatric patients with different PVT1 expression levels

此外，我們通過多因素Cox回歸分析驗證了PVT1以及各項臨床指標與預后之間的關系。結果如表3所示，PVT1(HR為3.274，95 %CI為1.173～9.143，P=0.024)、miR-16-5p(HR為0.142，95 %CI為0.178～0.955，P=0.039)均可作為重癥肺炎合并呼吸衰竭的獨立預測因子。

表3 多因素Cox分析臨床特征與總生存率的關系Tab 3 Multivariate Cox analysis of the relationship between clinical features and overall survival rate

2.6 miR- 16- 5p直接靶向PVT1的3′- UTR區

線上數據庫StarBase V 2.0預測PVT1與miR-16-5p的3′-UTR區域有結合位點，二者的互補序列見圖4A。隨后，采用熒光素酶報告基因對此結果進行分析，我們發現，轉染miR-16-5p mimic后野生型PVT1-3′-UTR組的熒光素酶活性顯著降低，而轉染miR-16-5p inhibitor后顯示野生型PVT1-3′-UTR組的熒光素酶活性明顯增強(P<0.001，圖4B)。另外，對于突變型PVT1-3′-UTR組而言，不管是轉染miR-16-5p mimic還是轉染miR-16-5p inhibitor均對熒光素酶活性無影響。以上結果表明，PVT1直接與miR-16-5p結合并負向調控其表達水平。

3 討 論

世界衛生組織(WHO)的統計數據顯示全世界每年近30%的新生兒死于重癥肺炎，而受重癥肺炎影響的兒童大約是1.56億例[16]。肺炎的發病相對較為隱匿，常常缺乏較為典型的臨床表現與體征，因而往往容易被誤診為上呼吸道感染，最終導致病情延誤及惡化。重癥肺炎是一種嚴重的肺部炎癥，常常伴隨著呼吸功能的衰竭，嚴重者將會影響循環系統，甚至危及生命安全[17]。目前而言，關于重癥肺炎的發病機制尚不完全清楚，但已被確證的機制涉及免疫系統與炎癥反應[18]。當前臨床上對于重癥肺炎的治療主要集中在抗感染治療、輔助恢復呼吸功能以及免疫支持治療3個方面[19]。對于重癥肺炎患兒而言，正確的診斷并進行積極的治療可有效地改善不良預后。

有研究[20-21]表明，PVT1作為致癌基因在癌癥患者的血液中表達升高，并且PVT1高表達患者的預后較差。另有研究[22]發現，PVT1在肺炎鏈球菌壞死性肺炎模型的組織中表達上調，而敲低PVT1后可抑制肺泡上皮細胞的凋亡及炎癥因子的生成。Liu等[23]報道，PVT1是膿毒癥患者發生急性呼吸窘迫綜合征的獨立危險因素。LncRNA通常作為競爭性內源性RNA(competitive endogenous RNA)，microRNA的“分子海綿”(miRNA sponge)而抑制miRNA的表達從而發揮基因調控作用。據報道[24]，過表達miR-16-5p在LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷中通過靶向CXCR3發揮對肺損傷的保護作用。Yin等[25]的研究發現，增強miR-16-5p的表達水平可抑制膿毒癥誘發的肺損傷，表現為抑制小鼠模型的肺組織水腫、抑制炎癥及細胞凋亡。本研究中我們發現，重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒血清PVT1水平顯著升高，而miR-16-5p水平則明顯降低。

A.miR-16-5p和PVT1的結合位點；B.轉染miR-16-5p mimic顯著抑制野生型PVT1 3′-UTR的熒光素酶活性，而miR-16-5p inhibitor則相反(***P<0.001)圖4 PVT1與miR-16-5p的靶向關系的驗證A.The binding sites of miR-16-5p and PVT1;B.Transfection of miR-16-5p mimic significantly inhibited the luciferase activity of WT-PVT1 3′-UTR,while transfection with miR-16-5p inhibitor showed the opposite result(***P<0.001)Fig 4 Verification of the targeting relationship between PVT1 and miR-16-5p

這與之前發表的相關研究結果具有一致性。Pearson相關系數分析miR-16-5p的表達與PVT1的水平呈負相關性，而患兒的部分臨床病理指標則與PVT1水平呈正相關。這說明PVT1與miR-16-5p可能同時在重癥肺炎合并呼吸衰竭中發揮作用，且PVT1水平與疾病嚴重程度有關聯。

大量研究證實lncRNA和miRNA有作為疾病診斷和預后生物標志物的潛能。例如，Pan等[26]證實PVT1對早期結腸癌具有潛在的診斷價值，并且在癌組織中過表達PVT1預示著患者的預后較差。有研究[27]證實在社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)患者中，入院時高水平的miR-146a-5p和miR-16-5p與隨訪30 d時較低的死亡率相關，兩種miRNAs都可作為CAP患者預后的生物標志物。本研究的ROC曲線分析結果顯示出PVT1和miR-16-5p對重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒而言具有較高并且相似的診斷價值，同時，二者聯合的ROC曲線并未顯示出更優秀的診斷價值，我們因此推測單獨的PVT1、miR-16-5p對疾病的診斷價值同二者聯合的診斷價值是近似的。此外，本研究進行了為期28 d的隨訪調查，對患兒發生不良預后的情況進行分析，我們發現PVT1高表達患兒發生死亡事件的人數較多，同時多因素Cox回歸分析表明PVT1在重癥肺炎合并呼吸衰竭中是獨立的預后因子。說明高表達PVT1的患兒具有較高的預后不良發生的概率。另外，我們通過熒光素酶報告基因實驗初步驗證了PVT1與miR-16-5p的直接靶向作用，這一結果與二者的相關性結果是一致的。盡管我們憑借實驗手段證明了PVT1對于疾病的診斷和預后價值，也初步驗證了PVT1與miR-16-5p的結合，但是二者在重癥肺炎合并呼吸衰竭中的具體機制以及他們是如何對疾病進行調控仍然是未知的，我們仍需要在此結果的基礎上進行深入的探討。

綜上所述，本研究證實在重癥肺炎合并呼吸衰竭兒童的血清中PVT1的表達增加，而miR-16-5p的表達減少，并且miR-16-5p的水平隨著PVT1水平的增加而降低。ROC曲線證明了PVT1作為生物標志物對疾病診斷的臨床價值。另外，高表達的PVT1與患者的預后不良有關，且PVT1是重癥肺炎合并呼吸衰竭的獨立預后因子。因此，我們推測PVT1具有作為重癥肺炎合并呼吸衰竭臨床診斷和預后評估的潛在的生物標志物的能力。