膀胱癌組織和血清miR-200b甲基化狀態與EMT及臨床病理特征的相關性研究

石小玲，顧葉飛，蔡蕓

(1.如皋市人民醫院 腫瘤內科，江蘇 如皋 226500；2.如皋市人民醫院 泌尿外科，江蘇 如皋 226500；3.如皋市人民醫院 病理科，江蘇 如皋 226500)

膀胱癌(bladder cancer，BLCA)屬于生物學異質性惡性腫瘤，可分為非肌層浸潤性(non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌層浸潤性(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)兩個亞型[1]。了解NMIBC向MIBC轉變的潛在機制對于BLCA臨床治療具有重要價值。上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是BLCA細胞發生肌層浸潤的關鍵步驟[2]。最近有研究證實，miR-200家族成員表達的缺失可能是調控腫瘤細胞發生EMT轉化的重要事件[3]，且miR-200家族成員多受到甲基化修飾的調控[4]?；诒碛^遺傳學的腫瘤標志物是檢測、診斷、評估預后和預測治療反應的有前途的工具，本研究旨在探討BLCA組織和血清中miR-200b甲基化狀態與EMT及臨床病理特征之間的關系，為尋找BLCA惡性化進展的生物學標志物提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在這項回顧性研究中我們收集了126例經病理診斷為BLCA患者的腫瘤組織標本，包括NMIBC患者65例，MIBC患者61例，所有患者均于2018年9月至2020年10月在我院泌尿外科接受根治性經尿道膀胱腫瘤切除術，同期選擇63例經病理證實為正常膀胱黏膜組織作為對照組，通過膀胱鏡檢查排除BLCA。126例BLCA患者中男93例，女33例，年齡32～81歲，平均(55.65±13.47)歲，對照組參與者中男49例，女14例，年齡31～83歲，平均(58.13±14.94)歲。所有BLCA患者出現無痛性肉眼可見的血尿，且經膀胱鏡檢查、超聲、盆腔CT或MRI進行診斷，另外完成體格檢查(包括尿常規、脫落性尿細胞學、尿液以及腹腔和盆腔腫瘤標志物檢查)；術前均未接受過放療、化療、免疫治療等。排除腎癌、腺性膀胱炎反復發作、尿石癥患者。另外所有參與者手術前獲取血液樣本，并提取血清保存在-80 ℃的血液庫中，且均簽署了知情同意書。本研究得到了本院倫理委員會的批準。

1.2 甲基化特異性PCR(methylation- specific PCR，MSP)法檢測組織和血清miR- 200b甲基化狀態

首先分別使用組織和血清DNA 提取試劑盒(德國 Qiagen 公司)對組織和血清基因組DNA進行提取，然后通過 EZ DNA 甲基化試劑盒-Gold(北京中西遠大科技有限公司)對DNA進行亞硫酸鹽修飾。之后分別加入經亞硫酸鹽修飾的DNA模板、10×緩沖液、Hotstar Taq DNA聚合酶、上游引物和下游引物、dNTPs進行基因擴增反應，最后取PCR產物進行凝膠電泳。檢測結果以經過甲基化處理的 DNA為陽性對照，以未經過甲基化處理的外周血淋巴細胞DNA(全基因組擴增)為陰性對照。miR-200b MSP甲基化引物：正向5′-GCGGGGTTCGGGTTTGCGTTATC-3′，反向5′-GCCCCACACAAATACGAACTCCCG-3′，126 bp；miR-200b非甲基化特異性引物：正向5′-GTTTGTGGGGTTTGGGTTTGTGTTATT-3′，反向5′-CACCCCACACAAATACAAACTCCCA-3′，131 bp。

1.3 實時熒光定量PCR(quantitative real- time PCR，qRT- PCR)法檢測血清miR- 200b水平

使用miRNeasy mini提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取血清miRNAs，用特制的miRNA種子特異性莖環引物(5′-GTCGTATCCAGTGCGTCGAGTGACACGAGAGCCACCTGGGCAATTTGCACTGGATACGACTCATCA-3′)反轉錄得到cDNA樣本。在逆轉錄反應之前所有的樣品都被預先孵育使RNA二級結構變性，并且使引物在60 ℃退火20 min。用cDNA樣本(稀釋25倍)為模板和Taqman 2×Master mix、通用逆轉錄引物(5′-TCGTATCCAGTGCGTCGAGT-3′)、miR-200b特異性正向引物(5′-CGCAGTAATACTGCCTGGT-3′)、TaqMan-MGB熒光標記探針(5′-CAGAGCCACCTGGGCAATTTT-3′)進行PCR擴增，總體積為10 μl。實驗采用7900HTqRT-PCR系統進行，反應條件為50 ℃反應2 min，95 ℃反應10 min用于初始變性，95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min用作引物退火，沒有cDNA模板的陰性對照同時包括在所有檢測中。用cel-miR-39-3p作為內源控制基因，相對表達水平定量使用2-ΔΔCq方法，取平均值用于分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組組織和血清中miR- 200b甲基化狀態

BLCA組患者腫瘤組織和血清中miR-200b甲基化率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。來自同一參與者的組織樣本和血清樣本中miR-200b甲基化檢測結果一致性良好(Kappa=0.715，P<0.001)，經McNemarχ2檢驗，差異無統計學意義(P>0.05)。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

圖1 不同組織和血清中miR-200b甲基化檢測瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis images of tissue and serum miR-200b methylation in different groups

表1 不同組別的組織和血清中 miR-200b甲基化狀態 %Tab 1 Methylation of tissue and serum miR-200b in different groups %

2.2 兩組血清中miR- 200b表達差異以及與甲基化狀態的關系

BLCA組患者血清中miR-200b表達水平顯著低于對照組(0.75±0.31vs.1.00±0.19)，差異有統計學意義(P<0.05)。而且對于BLCA組患者，miR-200b甲基化亞組血清中miR-200b表達水平顯著低于未甲基化亞組[0.61(0.32，0.82)vs.0.88(0.73，1.07)]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 BLCA患者組織和血清miR- 200b甲基化狀態與臨床病理特征的關系

BLCA患者組織miR-200b甲基化狀態與肌層浸潤、遠處轉移、組織學分級有關(P<0.05)，同時血清miR-200b甲基化狀態與肌層浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分級有關(P<0.05)，即MIBC亞型、發生遠處轉移或中低級別BLCA患者組織和血清miR-200b甲基化率更高，同時發生淋巴結轉移者血清miR-200b甲基化率也更高(P<0.05)，見表2。

表2 BLCA患者組織和血清miR-200b甲基化狀態與臨床病理特征的關系 例Tab 2 Relationship between tissue and serum miR-200b methylation and clinicopathological features in BLCA patients cases

2.4 生物信息學分析BLCA患者組織miR- 200b表達與EMT的相關性

基于癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫中的 miRNA-seq 數據以及miR-200b甲基化狀態，結果顯示BLCA患者miR-200b表達水平較正常膀胱組織顯著升高(P<0.05)(圖2A)；且miR-200b 基因存在多個CpG位點易發生甲基化(圖2B)，miR-200b高甲基化程度與miR-200b 表達水平呈負相關(P<0.05)(圖2C)。經Kaplan-meier曲線分析顯示,組織miR-200b低表達水平以及高甲基化狀態與總體生存率較低有關(P<0.05)(圖2D)。另外利用TCGA數據集，我們還證實了 miR-200b 表達水平與透明質酸合酶2(hyaluronan synthases-2，HAS2)、鋅指 e-box 結合轉錄因子(zinc finger E-box-binding homeobox，ZEB)1和ZEB2蛋白的表達水平呈負相關性(P<0.05)，見圖2E。

3 討 論

BLCA是泌尿系統惡性腫瘤，在我國超過30%的患者確診時已發生肌層浸潤[5]，MIBC屬于一種異質性、侵襲性的膀胱癌亞型，具有惡性化程度高、更易發生局部或遠處轉移、術后復發率高、預后差等特點[6]，然而并非所有的NMIBC都會進展至高度惡性表型的MIBC，表明兩者具有異質性的分子特征[7]。了解NMIBC向MIBC轉變的潛在機制對于BLCA臨床治療具有重要價值。本研究中我們發現，BLCA患者腫瘤組織和血清中miR-200b普遍呈高甲基化狀態，而且與腫瘤細胞肌層浸潤、遠處轉移、中低分化程度等臨床病理特征有關，故而推斷miR-200b表觀遺傳學改變可能參與了BLCA惡性化進展過程。

miRNAs是一類小分子(長度為21～25個核苷酸)非編碼RNA家族，通過6～8個堿基的種子序列與目標mRNAs結合，進而阻斷翻譯或降解mRNA來調節轉錄后水平的基因表達，這個過程取決于與目標mRNA序列的互補程度[8]。目前已發現miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429等5個成員，它們具有共同的種子序列，這些序列通過調節上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達來調節EMT過程[9]。例如Arunkumar等[10]發現,miR-200a、miR-200b、miR-200c、ZEB1、ZEB2、E-cadherin和波形蛋白(vimentin)等EMT調控基因表達失調是誘導口腔鱗狀細胞癌發生腫瘤轉移和化療耐藥的重要分子機制。Yeh等[11]報告也證實,miR-200c和miR-141同時沉默可能是肝癌通過激活EMT過程導致膽管轉移的原因。然而，miR-200b在BLCA中的特異性作用卻鮮少有研究。在本研究中我們發現，BLCA組患者腫瘤組織和血清中miR-200b甲基化率均高于對照組(P<0.05)，且來自同一參與者的組織樣本和血清樣本中miR-200b甲基化檢測結果一致性良好，說明核酸在腫瘤發生和發展的早期就被釋放到血液中，并帶有與腫瘤遺傳學和表觀遺傳學有關的異常變化，而且MSP是檢測或評估DNA啟動子區域甲基化最常用和經濟的方法之一，因此檢測外周血中miR-200b甲基化程度有望成為用于BLCA診斷、具有臨床應用前景的候選腫瘤標志物。

此外，BLCA組患者血清中miR-200b表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；而且對于BLCA組患者，miR-200b甲基化亞組血清中miR-200b表達水平顯著低于未甲基化亞組(P<0.05)，說明BLCA患者血清中miR-200b表達水平降低主要受到DNA表觀遺傳學調控的影響。甲基化誘導抑癌基因沉默是促進腫瘤生長和去分化的最重要的表觀遺傳機制之一。據報道，具有腫瘤抑制活性的miR-200b被DNA超甲基化沉默，從而導致循環血中相對表達水平降低[12]。我們的TCGA數據庫的分析結果與之基本一致，基于TCGA數據庫的分析證實miR-200b表達水平在BLCA組織中顯著降低，并且與DNA甲基化程度呈負相關性。

A.BLCA腫瘤組織(n=404)和正常膀胱組織(n=19)中miR-200b表達水平的差異性；B.Infinium BeadChip探針檢測miR-200b基因CpG島的位置(GRCh38/hg38)；C.Pearson法分析BLCA組織中miR-200b 表達水平與探針DNA甲基化的相關性(n=345)；D.Kaplan-meier 曲線分析顯示miR-200b 表達(n=353)和DNA甲基化(n=347)對BLCA患者總生存率的影響；E.miR-200b表達水平與原發性BLCA組織中HAS2、ZEB1、ZEB2表達的相關性(n=345)圖2 使用TCGA數據庫分析臨床BLCA腫瘤組織中miR-200b表達和DNA甲基化A.Difference of miR-200b expression between BLCA tissue(n=404)and normal bladder tissue(n=19);B.Infinium BeadChip probe was used to detect miR-200b gene CpG island location(GRCh38/hg38);C.Pearson assay was used to analyze the correlation between miR-200b expression and probe DNA methylation in BLCA tissue(n=345);D.Kaplan-meier curve analysis revealed the effect of miR-200b expression(n=353)and DNA methylation(n=347)on overall survival in patients with BLCA;E.The expression of miR-200b was related with the expressions of HAS2,ZEB1 and ZEB2 in primary BLCA tissues(n=345)Fig 2 Analysis of miR-200b expression and DNA methylation in clinical BLCA tumors using TCGA database

Tamagawa等[13]研究證明miR-200b表達在癌細胞中被下調，與調節ZEB1/ZEB2表達密切相關。ZEB2反義RNA1(ZEB2-AS1)是一個與ZEB2基因5′端剪接位點重疊的非翻譯區。ZEB2和ZEB2-AS1作為雙向順式自然反義轉錄本表達，對于下調E-cadherin蛋白表達是必不可少的。因此miR-200b被認為是EMT過程的重要調節因子，通過降低E-cadherin的表達增加vimentin表達，誘導EMT過程。我們通過分析TCGA數據庫中的患者數據證實，miR-200b表達水平與HAS2、ZEB1和ZEB2的表達水平呈負相關，這也解釋了為何發生肌層浸潤或遠處轉移的BLCA患者組織或血清中miR-200b甲基化程度更高，說明具有miR-200b低水平的腫瘤患者更具備發生肌層浸潤或遠處轉移的環境，而且miR-200b表達水平降低是通過改變啟動子甲基化事件來實現的。

綜上所述，BLCA患者組織和血清樣本中普遍存在miR-200b高甲基化狀態，而且發生肌層浸潤、遠處轉移、淋巴結轉移或中低分化程度的BLCA患者血清miR-200b甲基化率更高，這可能與其上調EMT相關轉錄因子的表達，進而激活EMT過程有關。