GC-MS法測定橡膠材料中N-亞硝基胺的不確定度評定

劉志榮

（中輕檢驗認證（晉江）有限公司，福建 晉江 362200）

前言

N-亞硝基胺，化學通式為R2N-NO,其可以通過消化道和呼吸道進入人體，同時可以通過人體皮膚接觸進入人體，誘發癌癥，同時能夠引起肝壞死等危害，而被人們所廣泛關注[1]。橡膠材料在生產過程中需要添加一些促進劑，在其硫化過程中會形成亞硝酸類物質而殘留其中。在特定環境下橡膠材料中殘留的亞硝基胺容易被釋放出來，對人體造成傷害。科研工作者進行了大量的試驗，已證明N-亞硝基胺在人類體內可能會將DNA 烷基化，最終誘發癌癥[1-2]。

隨著居民家庭收入的提高，童鞋市場規模的不斷擴大，我國童鞋產業迅速擴張，橡膠制品是童鞋的主要材料之一，童鞋甚至是嬰幼兒鞋類質量安全對于兒童健康成長發育有一定的影響[2]。國際上多個國家或地區專門制定針對鞋類橡膠材料中N-亞硝基胺含量的檢測方法，例如ISO 19577-2019[3]Footwear-Critical substances potentially present in footwear and footwear components Determination of Nitrosamines。對于鞋類產品橡膠部件中N-亞硝基胺含量的要求，國內相繼出臺了多個標準對其進行限定，最為常見的為GB 30585-2014[4]中要求嬰幼兒鞋的橡膠部件中不應檢出N-亞硝基胺。歐盟在2009/563/EC 的鞋類生態標簽指令中[2]，對9 種N-亞硝基胺進行限定，要求不得檢出。

通過不確定度各分量來源的分析和計算，可以評估檢測結果的準確性，從而提高檢測質量。本文根據GB/T 27418-2017[5]《測量不確定度評定與表示》及JJF 1135-2005[6]《化學分析測量不確定度評定》中的相關規定，依據GB/T 24153-2009[7]對鞋類材料中N-亞硝基胺的測定方法，考慮標準品、工作曲線的擬合、樣品測定重復性、稱量及標準溶液配置等方面進行不確定度的評定，為氣質聯用法準確測定橡膠材料中N-亞硝基胺的含量提供參考[8-9]。

1 材料與試驗方法

1.1 實驗原理

橡膠試樣采用甲醇作為提取溶劑，在超聲波下提取，提取液使用旋轉蒸發儀濃縮，再使用C18 固相萃取小柱凈化，樣液進GC-MSD 進行測定，全掃描定性，選擇離子定量[7]。

1.2 儀器及試劑

5977B-7890B 氣質聯用儀(安捷倫科技公司)；電子分析天平（精度0.001 g，梅特勒-托利多集團）；高功率超聲清洗器（KQ-400KDE，昆山市超聲儀器公司）[10]；甲醇（色譜純，Tedia 公司）[10]；旋轉蒸發儀（可控溫35 ℃，廣州儀科實驗室技術公司）；C18 固相萃取小柱；12 種N-亞硝基胺混合標液(曼哈格生物科技)其中12 種混合標準溶液中分別為：N-亞硝基二甲基胺CAS:62-75-9 N-亞硝基甲基乙基胺CAS:10595-95-6 N-亞硝基二乙基胺CAS:55-18-5 N-亞硝基吡咯烷CAS:930-55-2 N-亞硝基-N-甲基苯胺CAS:614-00-6 N-亞硝基嗎啉CAS:59-89-2 N-亞硝基二丙基胺CAS:621-64-7 N-亞硝基哌啶CAS:100-75-4 N-亞硝基-N-乙基苯胺CAS:612-64-6 N-亞硝基二丁基胺CAS:924-16-32 N-亞硝基二苯基胺CAS:86-30-6 N-亞硝基二芐胺CAS:5336-53-8 以下內容用CAS 號表示該物質。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 N-亞硝基胺12 種混標中間液的配制

取0.5 mL N-亞硝基胺混標（12 種）母液（200 mg/L）至10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到濃度為10 mg/L 的儲備液。

1.3.2 N-亞硝基胺12 種混標工作液的配制

根據表1 所示移取1.3.1 中儲備液配置成標準工作液。

表1 N-亞硝基胺標準工作液配置表

1.4 樣品處理

1.4.1 試樣制備及提取

稱取5.0 g（準確至0.01 g）邊長為3 mm 以下的試料，于加入30 mL 甲醇的反應器里，使用高功率超聲清洗器進行超聲30 min，然后把溶液移入濃縮瓶中。再次加入20 mL 甲醇于反應器中，提取第2 次，然后合并溶液[7]。

1.4.2 蒸發濃縮

將濃縮瓶置于35 ℃水浴，使用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至4.5mL 左右，將樣液移入5mL 容量瓶，另取0.5mL 提取溶劑淋洗瓶壁內部，再次振蕩1min，移入上述容量瓶，用提取液定容至5mL[7]。

1.4.3 凈化

用5 ml 甲醇活化C18 小柱，用移液器量取2.0 ml 樣液于C18 小柱里，收集流出液于離心管，再加2 mL 甲醇淋洗，收集洗液于離心管。最后氮吹至2 mL,供氣質聯用測試[7]。

1.5 儀器參數

a）色譜柱：DB-35MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm 或相當者；

b)色譜柱溫度：起始溫度40℃（保持4 min）以8 ℃/min 速率加熱到83 ℃(保持4 min）以15 ℃/min 速率加熱到280 ℃(保持6 min)；

c)進樣口溫度：260 ℃；傳輸線溫度：280 ℃[11]；

d)質量掃描范圍：(15-280)amu；測定方式：SIM；電離方式：EI，能量70 eV[11]；

e)進樣：不分流；進樣量：1 微升。

2.1 不確定度分析

2.1.1 數學模型

X-橡膠材料中N-亞硝基胺的含量，單位mg/Kg；C-從工作曲線中N-亞硝基胺的濃度，單位；V-提取液的體積，單位mL；m-樣品的質量，單位g。

2.1.2 稱樣引入的相對標準不確定度urel(1)

采用0.001 g 電子分析天平，根據校準證書上示值誤差為0.002 g，因此天平引入的相對標準不確定度：

2.1.3 標準品引入的相對標準不確定度urel(2)

根據標準品廠商提供的證書，在置信水平95%，k=2，各個N-亞硝基胺類的相對標準不確定度均為0.03000。

2.1.4 標準工作溶液濃度引入的不確定度urel(3)

以N-亞硝基二甲基胺（CAS：62-75-9）為例，那么不確定度的來源主要為：10 mL 容量瓶、1000 μL 移液器和環境溫度對體積產生的影響[10]。

根據10 mL 容量瓶校準證書可知，體積誤差為0.007 mL，那么相對標準不確定度。

根據1000 μL 移液器校準證書給出的誤差為0.004 mL，那么相對標準不確定度為。

甲醇在20 ℃下的膨脹系數為0.0011/℃，溫度引入的相對標準不確定度按矩形分布計算，試驗環境溫度允差為5 ℃，因此溫度引起的相對標準不確定度

因此，由62-75-9 標準工作溶液濃度引起的不確定度u(62-75-9)rel(3)為：

2.1.5 重復性引入的相對不確定度urel(4)

測試加入標準溶液為1.5 mg/kg 的空白樣品進行六次重復性測試結果見表2，重復性引入的相對標準不確定度為以u(62-75-9)rel

表2 樣品測量重復性引入的相對不確定度

(4)為62-75-9 例計算為：

2.1.6 工作曲線的擬合引入的不確定度urel(5)

本文采用外標法定量，以62-75-9 為例工作溶液5 個濃度點分別為250、500、750、1000、1500 μg/L 的12 種N 亞硝基胺類工作溶液分別測定1 次，得到的響應值為縱坐標，濃度值為橫坐標，擬合工作曲線得 到 y=bCi+a=102.6Ci-1307，截 距a=-1307，斜率b=102.6，n=5，樣品重復測量兩次，那么標準偏差S 為[10]：

根據u(5)公式計算工作曲線擬合引入的標準不確定度為[10]：

式中：n——測試標準溶液的次數，n=5；P——測試樣品的次數，P=2；C——測定樣品中62-75-9 濃度平均值，C=1463.28；——N 亞硝基胺標準溶液濃度平均值，=800；Ci——標準系列溶液的濃度值；b——標準曲線的斜率。S——標準偏差[10]。

表3 工作曲線的擬合引入的相對標準不確定度

2.1.7 合成及擴展不確定度的評定

以62-75-9 為例計算N-亞硝基胺不確定度的結果見表4。62-75-9 合成相對標準不確定度u(62-75-9)crel(c)為：

表4 N-亞硝基胺的不確定度結果

試樣中N-亞硝基胺62-75-9 的最終測定結果為1.46mg/Kg，合成標準不確定度為u(62-75-9)(c)=c×u(62-75-9)crel(c)=1.46×0.0316=0.0461 mg/Kg。

在置信概率95%，k=2，那么測量結果的擴展不確定度U(62-75-9)為：U(62-75-9)=k·u(62-75-9)(c)=2×0.0461=0.09 mg/Kg。

62-75-9 結果的表示為：C=(1.46±0.09)mg/Kg，k=2。

3 結論

對于采用氣相色譜-質譜聯用法測量N-亞硝基胺含量時，由表4 可知，不確定度來源中標準品和工作曲線對測定過程不確定度最大。

根據評定不確定度的結果，日常檢測中需采取措施減小不確定度的引入。在申購標準品過程中，必須選擇不確定度相對較低的標準品，可以有效減小不確定度的引入；建立作業指導書標準化操作步驟和儀器操作規范，提高技術人員能力，減少試驗誤差；配置標準溶液時減少稀釋次數，操作又快又準，也可減小不確定度的引入從而確保檢測數據的準確和可靠。