ε-聚賴氨酸作為天然防腐劑在食品中的應用研究進展

胡思嘉，李新福，熊 強

（南京工業大學食品與輕工學院，江蘇南京 211800）

近些年來，由于濫用食品防腐劑所引起的食品安全事故頻發，消費者對相關問題的關注和擔憂日益增長[1]。因此，天然防腐劑的研究和應用逐漸成為相關研究人員關注的重點。天然防腐劑有多種來源，包括植物、動物、微生物（細菌、藻類和真菌）[2]。植物源防腐劑包括迷迭香、丁香提取物、綠茶和姜黃等，其含有的活性物質已被證實具有抗氧化性和抗生物活性[3]，在食品保存上能發揮關鍵作用；動物源防腐劑包括溶菌酶、乳過氧化物酶、乳鐵蛋白、卵轉鐵蛋白、抗菌肽和殼聚糖[4]；微生物源防腐劑主要包括細菌素和有機酸兩大類，其中細菌素因其良好的抗菌活性且不影響食品感官品質的特性[5]，在食品防腐領域的應用愈加廣泛。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種天然生物防腐劑，是白色鏈霉菌以葡萄糖作為碳源發酵得到的代謝產物之一[6]。ε-PL是由25～35個賴氨酸殘基通過分子間羧基與氨基縮合形成酰胺鍵連接而成的L-賴氨酸同型聚合物，作為一種無毒、安全、可生物降解的多氨基聚合物，廣泛用于醫用抑菌和食品保鮮[7]，對致病性病原體如枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌、酵母和霉菌有抗菌活性[8]。2003年，ε-PL被美國食品藥品監督管理局批準為安全食品添加劑，此后在日本得到廣泛應用，常見于米飯、面條、壽司、生魚片和沙拉等食品中[9]。2014年，我國正式批準ε-PL作為食品添加劑新品種[10]，可用于焙烤食品、熟肉制品和果蔬汁類制品，其中果蔬汁類制品的最大使用量為0.2 g/L。ε-PL不僅能作為天然防腐劑在食品加工中發揮極為重要的作用，還能應用于食品包裝。研究發現將ε-PL參入到明膠基質中制成的明膠/ε-PL活性可食用膜用于食品包裝，能有效抑制食源性病原微生物的生長，防止食品貯藏中的氧化變質[11]。目前，國內外有許多關于ε-PL的綜述，大多集中于其在不同食品中的防腐作用，關于抑菌機理方面缺乏系統總結。本文論述了近年來部分學者對ε-PL的抑菌機理研究，同時對ε-PL作為天然防腐劑在食品保鮮的應用進行介紹，并簡單討論了ε-PL在食品領域存在的問題，以期為ε-PL的抑菌機理研究和在食品工業中的進一步應用提供參考。

1 ε-聚賴氨酸的結構和理化性質

1.1 結構

ε-PL是一種聚酰胺，由25～35個L-賴氨酸殘基通過ε-氨基和α-羧基縮合形成的酰胺鍵連接而成[12]，結構如圖1所示[13]，分子量2～5 kDa[14]，作為天然防腐劑應用食品保鮮的ε-PL通常由30個賴氨酸單體構成，分子式為C180H362N60O31[15]。

圖1 ε-PL 分子結構[13]Fig.1 Molecular structural formula of ε-polylysine [13]

1.2 理化性質

天然存在的ε-PL是水溶性的，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有機溶液[16]；具有良好的熱穩定性，其水溶液在120 ℃高溫滅菌處理20 min不會發生分解作用[17]；具有廣譜抑菌性，對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌的生長繁殖具有良好的抑制作用[18]。Hiraki等[19]等對ε-PL進行了毒藥物動力學檢測，證實了其對人體生殖系統、神經系統、免疫系統、胚胎和胎兒的發育均不存在毒性作用，而且ε-PL在人體內可被降解成賴氨酸，作為必需氨基酸被人體吸收[20]。因此，鑒于ε-PL優異的熱穩定性、抗菌活性和無毒性，可作為防腐劑廣泛用于食品保鮮防腐工業。此外，在食品工業中應用得更加廣泛的是聚合度不超過36的天然ε-PL，原因在于聚合度低的ε-PL對某些微生物的抑制作用要好于聚合度較高的，且前者苦味較不明顯，能夠改善食品的感官品質[21]。

2 ε-聚賴氨酸的抑菌性及抑菌機理

目前關于ε-PL抑菌機理的研究主要集中在金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及單核細胞增生增李斯特菌等，大部分是從ε-PL對微生物細胞壁和細胞膜系統、遺傳物質、酶或功能蛋白的破壞三方面闡述其抑菌機制[22]。

2.1 作用于細胞壁和細胞膜系統

細胞壁和細胞膜系統是隔絕細胞內外環境的重要屏障，營養物質的吸收和代謝廢物的排放均離不開這兩大屏障。作為陽離子表面活性劑，ε-PL可以通過靜電吸附在微生物細胞表面上，破壞了細胞壁和細胞膜的完整性，導致細胞質分布異常[23]。

據推測，聚陽離子能夠抑制膜受體的活性，在脂質膜中形成脂質結構域（筏），影響脂質分子在兩層脂質的小葉之間的分布，誘導融合和破壞生物膜，所有這些現象改變了生物膜的結構組織和特性，從而影響了細胞的功能[24]。王梓源等[25]以大腸桿菌作為模式菌株，研究了ε-PL作用下E.coli的生長曲線、存活率，以及ε-PL對E.coli細胞表面疏水性、內膜及外膜穿透活性的影響，發現E.coli的生長在ε-PL存在時受到明顯抑制，且抑制效果和ε-PL濃度呈現正相關；此外，ε-PL的處理能夠明顯增大E.coli細胞的表面疏水性以及電導率，從而導致細胞膜流動性降低，穩態遭到破壞，達到抑菌效果。同時，Blachechen等[26]在噴涂薄膜的抗菌性能實驗中發現ε-PL對大腸桿菌的抑制效果要好于金黃色葡萄球菌，這是由于以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌細胞壁外膜組分為脂多糖，ε-PL與帶負電的脂多糖可以通過靜電作用結合，破壞脂多糖結構，從而破壞細菌外膜，抑制生長。Shao等[27]在研究ε-PL乳清蛋白復合物對大腸桿菌抑制作用的過程中，揭示了ε-PL的殺菌過程，ε-PL和細菌膜通過靜電作用彼此靠近，帶正電的氨基與膜頭部基團的氧原子之間形成的氫鍵捕獲細菌膜的磷脂分子，隨著更多的氫鍵形成，ε-PL像毯子一樣緊貼在膜表面，最終影響膜分子之間的相互作用，并導致細菌死亡，如圖2所示。此外，在低pH條件下，ε-PL有更強的抑菌效果，由于在酸性條件下的氨基質子化，具有強的正電荷，促進ε-PL在細菌膜上的吸附。但是研究證明，即使溶液的pH為12.0，ε-PL仍能保持良好的活性，這說明它的靜電作用實際只是ε-PL抗菌機理的一部分[28]。

圖2 ε-PL乳清蛋白復合物抑菌機理[27]Fig.2 Antibacterial mechanism of whey protein-ε-PL complexes[27]

2.2 作用于遺傳物質

大量研究表明，ε-PL的抑菌作用可能與細胞內活性氧（ROS）誘導的細胞凋亡有關。Ye等[29]采用ROS探針測量經ε-PL處理的大腸桿菌ROS濃度，發現ε-PL誘導了ROS和SOS反應的產生，同時也影響細胞死亡以及調節相關基因的表達水平。同時，Tan等[30]研究了經ε-PL處理的釀酒酵母中ROS水平和核DNA變化，結果表明，ε-PL會引起酵母細胞中ROS的積累以及DNA片段化，最終導致細胞死亡。此外，還有學者探討了ε-PL對腸球菌的抑制作用時，發現低濃度條件下，DNA在ε-PL凝膠中的遷移仍然會受到阻礙，說明ε-PL有很強的DNA結合能力，阻止DNA復制，從而影響基因在微生物體內的表達[31]。

2.3 作用于酶或功能蛋白

此外，還有部分學者研究了ε-PL對微生物的酶或蛋白質的影響，以此解析其抑菌機理。寧亞維等[32]以金黃色葡萄球菌作為指示劑，分別以抗菌肽brevilaterin、ε-PL、抗菌肽 brevilaterin和ε-PL 的混合液處理金黃色葡萄球菌，以未添加抑菌劑的為對照組，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白含量，結果顯示ε-PL處理后蛋白質條帶整體灰度變淺，且在分子質量小于14.4 kDa處，ε-PL、聯用組處理后蛋白質條帶灰度加深，這表明ε-PL對大分子蛋白質的合成有抑制作用或者是能將大分子蛋白質降解為小分子蛋白質。在某些蛋白質的翻譯過程中，ε-PL的存在也會影響翻譯的繼續，因為帶正電荷的殘基之間的排斥力會阻止α-螺旋的形成[33]。此外，ε-PL對微生物的呼吸系統防御酶和三羧酸循環關鍵酶具有一定的抑制作用[34]。以腐敗希瓦氏菌為例，隨著ε-PL濃度增加，過氧化物酶和過氧化氫酶活性下降，導致碳水化合物的代謝受阻，進而阻礙細胞生長，甚至引起細胞死亡，琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的抑制機制與之相似，兩者都是通過靶向抑制的方式抑制細菌的代謝活性，如圖3所示[35]。

圖3 ε-PL對腐敗希瓦氏菌的抑制機制[35]Fig.3 Inhibitory mechanisms of ε-PL against S.putrefaciens[35]

3 ε-聚賴氨酸在食品保鮮中的應用

ε-PL因其具有良好的抑菌功能和安全性能，在日本、韓國和世界其他地區已被普遍用作食品添加劑[36]，在日本多應用于米飯、面條、魚類/壽喜燒、沙拉等食品中。近年來，國內外對ε-PL防腐保鮮應用的研究大多集中于果蔬、鮮乳及乳制品、肉制品以及水產品，相關學者不僅探究了ε-PL的單獨抑菌作用，還進一步探討了ε-PL與其他防腐劑或防腐技術的聯用效果。

3.1 ε-PL保鮮果蔬

果蔬產品富含維生素和礦物質，可提高人體免疫力并預防疾病的發生，是人們日常飲食中不可缺少的物質[37]。新鮮果蔬極易腐爛，在運輸和銷售過程中易發生化學變化和微生物降解，會導致香氣、味道和顏色等特征質量的下降以及有害病原體的生長[38]。為了提高果蔬產品的存儲時間，研究者提出了許多物理、化學等保存手段，但出于安全性以及對食品營養價值和風味的考慮[39]，研究人員逐漸關注天然防腐劑在果蔬保鮮中的應用。

研究發現了ε-PL能有效降低冰溫條件下櫻桃和藍莓的腐爛程度[40-41]，保持新鮮率，隨著濃度升高，保鮮效果越好，濃度分別為500 mg/L、300 μL/g時兩者能達到最佳的保鮮效果，而且適當的ε-PL處理對抑制維生素C、花色苷的減少也有很明顯的效果。ε-PL還能作為一種控制水果采后病害的有效策略?；颐共∈枪咧凶罹咂茐男缘募膊≈?，由灰葡萄孢菌引起，能嚴重影響果蔬采后的儲存[42]。目前已經證實石蒜堿[43]、殼聚糖[44]對灰霉病有一定的抑制作用，而在Li等[45]的實驗中，當ε-PL濃度達到150 mg/L，灰葡萄孢菌菌絲體的生長也會受到了顯著的抑制，通過研究，發現ε-PL處理的灰葡萄孢菌的細胞中的ROS水平較高，并且與ε-PL的濃度呈正相關，這也說明ε-PL抑制灰葡萄孢菌生長繁殖的原因在于ROS積累的誘導，同時ε-PL還會破壞細胞質膜的完整性。

除此之外，ε-PL能與其它防腐技術聯合作用，包括非熱處理的物理方法[46]（紫外線、超聲波、脈沖電場等）以及與一些天然保鮮劑的復配。如使用適當的UV-A光照結合ε-PL處理鮮切菠菜，能夠延緩腐敗菌的生長以及維持菠菜本身良好的抗氧化性能[47]。研究還發現ε-PL結合殼聚糖處理蘋果，不僅能延緩貯藏期間蘋果品質的變化[48]，而且能降低青霉病的發生[49]。Song等[50]證實了乳酸鏈球菌素、殼聚糖和聚賴氨酸復配涂膜對鮮切胡蘿卜的白化現象能表現出積極的抑制作用。

相比于其他物理、化學等果蔬保鮮方法，ε-PL是一種更加安全、健康、綠色的保存手段，在延緩腐敗的同時，也維持了果蔬的營養價值和風味。

3.2 ε-PL保鮮乳及乳制品

乳制品營養豐富，含有鈣、鐵、鋅、銅等豐富的礦物質，如今許多乳制品需要長期保存，因此需要進行殺菌處理以防止變質并延長其保質期[51]。目前食品工業中大多采用巴氏殺菌、超高溫瞬時殺菌對乳制品進行滅菌處理，但都存在蛋白質變性、風味變化等問題[52]，ε-PL的出現為解決這些問題提供了新思路。

實驗證明了ε-PL能有效抑制牛乳中沙門氏菌[53]、單核細胞增生李斯特菌[54]和金黃色葡萄球菌[55]的生長繁殖。奶酪中添加適量濃度的ε-PL不僅可以控制腐敗霉菌的生長，還能保持其感官品質[56]。韓晴[57]通過對照試驗證實ε-PL可以使牛乳中的金黃色葡萄球菌細胞結構受到損傷，其損傷程度與ε-PL濃度呈現正相關，結果表明ε-PL還可以降低乳中乳糖及蛋白質的減少量、抑制乳中酸度增加、推遲牛乳凝固時間，延緩了牛乳貯藏過程中的風味變化。此外有學者研究發現月桂酰精氨酸和ε-PL聯合使用能夠更明顯地抑制全脂乳中單核細胞增生李斯特菌地生長[58]，具有這種協同抗菌作用的物質還有山梨酸鉀[59]和乳酸鏈球菌素[60]。還有學者采用高壓輔助ε-PL進行脫脂奶滅菌，證實在相同的滅菌條件下，添加ε-PL能降低高壓處理產生的蛋白質變性程度以及營養成分減少[61]。

盡管ε-PL的使用能在一定程度上避免傳統熱殺菌導致的蛋白質變性等問題，但是國內外關于ε-PL在乳制品方面的報道研究仍然比較少，尤其是將ε-PL與傳統乳制品殺菌技術相結合方面的研究，需要進一步探討。

3.3 ε-PL保鮮肉制品

一般來說，肉制品容易受到微生物污染的原因與其水分活度和蛋白質含量有關，實驗研究中常用菌落總數、pH、揮發性鹽基氮（TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（TBA）值來評價肉制品的腐敗程度[62]。

研究發現ε-PL可以抑制新鮮雞胸肉中的脂質氧化、核苷酸分解和蛋白質分解[63]，還能有效抑制生鮮鴨肉儲藏過程中TVB-N含量的升高[64]。在熟肉制品中，如牛肉泥中添加ε-PL，能有效抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌的生長，但三種病原菌對ε-PL的敏感性并不相同，這種差異可能是細菌細胞壁和表面電荷的差異所致[65]。此外，在一些肉制品的保鮮上，有學者將ε-PL與其它天然抗菌劑結合，研究協同抗菌能力。如ε-PL、谷胱甘肽的殼聚糖復合涂料不僅能抑制牛肉片中腐敗微生物的生長，降低冷藏過程中pH和TVB-N值增加，還能防止牛肉片產生褐變以及感官品質的下降[66]。Liu等[67]將結合八角茴香精油、ε-PL、乳酸鏈球菌素的活性涂料應用于肴肉保鮮，可以使其貯藏期由8 d變為10 d，并很好保留樣品的顏色、氣味和整體接受度，提高易變質即食肴肉制品的質量和保質期。還有研究發現將ε-PL或ε-PLN（?-聚賴氨酸納米顆粒）結合植物提取物（包括綠茶，橄欖葉和刺蕁麻提取物）替代亞硝酸加入到香腸中可以使其在冷藏過程中具有較高的抗菌、抗氧化和感官功效[68]。

實際上，ε-PL的單獨添加更多出現在一些熟肉制品的加工過程中，而對于冷鮮肉類，大多數是通過制備ε-PL與其他物質結合形成的可食用涂膜進行保鮮，既延長了保質期，也不會對環境造成破壞。

3.4 ?-PL保鮮水產品

水產品在我們的日常飲食中隨處可見，它包含了蛋白質、長鏈多不飽和脂肪酸、維生素、礦物質等許多營養素，長期食用這些產品能夠提高身體機能[69]。然而，正是由于其營養豐富的性質，在微生物和酶的作用下，很容易引起水產品在貯存和銷售過程中發生變質[70]。傳統的水產品保鮮主要有冷凍保存、化學保存、輻照保存等，冷凍保存在運輸過程中需要采取冷鏈運輸，成本較大，化學保存效果良好，但長期食用會對人體產生不利的影響[71]。輻照是滅活漁業產品中食源性病原體和腐敗細菌的有效措施，但消費者仍然擔心它的安全性[72]。因此生物保鮮技術受到了廣大研究者的關注，成為國內外水產品保鮮研究的焦點。

?-PL作為安全、高效的天然防腐劑，在水產品保鮮方面具有良好的應用前景。用?-PL處理黃花魚[73]、龍蝦[74]、魷魚[75]，發現儲存過程中微生物的生長均能受到不同程度的抑制，這有利于維持良好的感官品質，延長貨架期。?-PL還能減少魚類產品腥味的產生，冷藏期間河豚中的醛類含量升高，產生強烈的魚腥味，經?-PL處理后，相關化合物的含量有一定程度的降低，原因在于?-PL有效抑制了脂質氧化[76]。此外，研究發現，具有高聚合度（20～30 k）的?-PL 能有效地抑制魚糜制品在冷藏儲存后期出現的蠟狀芽孢桿菌，一方面以?-PL為代表的抗菌物質可促進蠟狀芽孢桿菌分泌多糖和蛋白質類物質，從而導致細菌粘附和聚集；另一方面，?-PL會破壞細胞膜并改變膜的通透性，從而導致蛋白質和DNA等細胞成分的釋放[77]。這表明?-PL可以作為抑制蠟狀芽孢桿菌的有效試劑，從而確保魚糜產品的安全性和質量。

ε-PL是良好的水產品保鮮劑，對水產品中的特定腐敗微生物均有明顯的抑制作用，同時，越來越多的研究表明ε-PL復合其他保鮮技術能達到更理想的水產品保鮮效果，這也為不同水產品的保鮮提供了更多的可能性。

4 展望

?-PL作為一種優良的天然生物防腐劑，具有廣譜抑菌性和生物相容性，能夠有效抑制食品中腐敗微生物的生長繁殖，延長食品貨架期。除此之外，?-PL在醫藥、紡織等方面也有廣闊的應用發展前景。雖然?-PL在食品保鮮領域中應用效果較好，但是其規模化生產和推廣仍面臨巨大的挑戰，在國內的應用也沒有日本等地區那么普遍。此外，目前國內外對其抑菌機理的研究仍然較少，大多數實驗研究是從?-PL對微生物細胞膜的破壞作用開展，而在核酸、蛋白質方面的機理研究尚不完整，還有待進一步的探索與拓展。同時，關于?-PL作為防腐劑單獨用于保鮮的研究較少，更多的是?-PL與其他物質的聯合處理，例如殼聚糖、VC、植物提取物等，而在相關的實驗中，這些聯合作用確實顯示出了更優異的抑菌效果，進一步證明了?-PL對食品抑菌的可行性。但在?-PL和這些物質的聯合作用機制以及原理方面，依然需要更為深入的探索。