魚鰾膠原肽的制備工藝及功能活性研究進展

董 旭，趙 峽,2, ，劉楚怡,2,

（1.中國海洋大學醫學院藥學院海洋藥物教育部重點實驗室，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266000）

中國水產資源豐富，同時也是水產品消費大國，隨著生活水平的提高，人們對于水產品的需求也不斷增加，同時水產品的加工副產物也在增多。魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗、魚鰾、魚內臟等占比總質量的40%以上，大部分副產物都會廢棄，不僅浪費了資源，還污染了環境，因此高值化利用水產品加工副產物就成為了學者們研究的目標。其中魚鰾是魚用于平衡和比重調節的重要器官，用于感壓、輔助呼吸等，自古以來就被應用于藥物和食品中。通常，魚鰾膠原蛋白含量與魚皮中膠原蛋白含量大致接近，卻又明顯高于魚骨、魚鱗、魚鰭、魚肉及內臟[1-5]。在水凝膠制備過程中，由于牛皮和魚皮等膠原纖維形成速度慢且穩定性不佳[6]，而魚鰾膠原蛋白具有快速的纖維形成能力[7]和較高的變性溫度[8]。因此，魚鰾膠原蛋白較適合作為哺乳動物膠原蛋白替代來源。

新鮮魚鰾中蛋白質含量很高，如新鮮鯽鰾組織中蛋白質含量高達84.2%，膠原蛋白含量為115.05 mg/g，鱈魚魚鰾中蛋白質可達到20%，脂肪卻很少。魚鰾膠原蛋白具有卓越的生物相容性、低免疫原性、可降解性等，易于人體的吸收和利用，并具有明顯功效，可有效提高免疫力、抑制癌細胞、活化細胞、防止皮膚老化去除皺紋[9]。但當前國內研究并不完善，其制備分離、功效因子、應用等方面研究關注不足，為此，本研究中系統地綜述了魚鰾膠原蛋白的研究現狀并探討了其應用發展。

1 魚鰾膠原肽的制備工藝

目前，魚鰾膠原蛋白研究的原料主要來自于草魚、鱈魚、黃姑魚、鯉魚、鱸魚、鮭魚等[10-11]魚的加工副產物。此類原料中富含膠原蛋白，對這些原料進行預處理、蛋白提取、分離純化等操作來得到具有生物活性的膠原蛋白。

1.1 預處理

在魚鰾膠原制備過程中，前處理非常重要，脂肪、雜蛋白以及鈣質的脫除效果會影響之后膠原的提取質量[12]，通常用醇（異丙醇、丁醇等）或堿來脫除脂肪[4]，用酸（鹽酸、乙酸、乙二胺四乙酸等）脫鈣[13]，除雜蛋白工序主要采用氯化鈉或氫氧化鈉處理，在處理時可用磁力攪拌器、超聲波等提高除雜效果[14]。

1.2 膠原蛋白提取

天然肽主要存在生物體內，所以在制備過程中，提取過程尤為重要，預處理保證了雜質的消除，正式提取則要最大化膠原蛋白的提取量和生物活性。常用的提取方法有酸法、酶法、熱水法、鹽法、堿法和發酵法[15]。在實驗時也可以多種方法結合使用以提高提取率。

1.2.1 酸法 酸法提取膠原蛋白主要在酸性條件下浸漬處理原料，從而破壞分子間的鹽鍵和希夫堿，而引起纖維膨脹、溶解[16]。作為溶劑使用的酸，主要有鹽酸或亞硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、檸檬酸和甲酸等[15]。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法，用酸法提取的膠原最大程度地保持了其三股螺旋結構。此法處理快速，所得產物的分子是連續的。

因不同魚類魚鰾中膠原蛋白結構組成不同，為得到生物活性更高的膠原蛋白肽，故所用方法和操作流程有所不同。李娜等[17]在研究鱈魚魚鰾時用5倍體積的0.5 mol/L的醋酸溶液溶解鹽析后的沉淀樣品，注入透析袋，用0.1 mol/L醋酸溶液透析1 d，再用去離子水透析2 d得到酸溶膠原蛋白，提取率約為10.23%。Chen等[18]以 0.5 mol/L醋酸，料液比為1:50（m/V），提取時間24 h的條件下提取黃姑魚鰾的膠原蛋白，最終得率約為11.33%。Pal等[7]用0.5 mol/L水醋酸提取鯉魚鰾中的膠原蛋白，連續溫和攪拌72 h，得率約為22.2%。Sinthusamran等[19]從鱸魚（Lates calcarifer）的魚囊中分離出酸溶性膠原蛋白（Acid soluble collagen，ASC），先用 0.5 mol/L乙酸溶解前處理過的樣品，隨后用0.1 mol/L乙酸透析12 h，魚鰾ASC的得率約為28.5%。Kaewdang等[20]將黃鰭金槍魚魚鰾脫脂后的樣品置于攪拌器連續攪拌，浸泡在0.5 mol/L醋酸中，在4 ℃下連續攪拌48 h，經過沉淀離心后，將沉淀溶解在0.5 mol/L的醋酸中，用10倍體積的0.1 mol/L醋酸透析12 h來提取膠原蛋白，但是最終得率僅為1.07%，這一結果與Singh等[21]的觀點一致，他們在2011年發現了條紋鯰魚皮膠原蛋白在0.5 mol/L醋酸中不能被完全水解。酸法提取膠原蛋白得率較少的原因，可能是由于魚鰾中的膠原蛋白通過端肽區醛基的縮合以及分子間的交聯而形成共價鍵交聯，導致膠原在酸性條件下的溶解度下降[21]。

1.2.2 酶法 酶法提取膠原蛋白是利用蛋白酶使膠原溶解，水解條件溫和，反應速率快，蛋白純度高，理化性質穩定，且無環境污染[15]。工藝可選擇一步法，即利用酶液直接提取；二步法，即先用酸或者堿進行初步提取，然后再用酶提取。Zhao等[22]選擇了豬胃蛋白酶來制備鮸的魚鰾膠原蛋白，經過單因素實驗篩選結果表明豬胃蛋白酶水解最佳條件為水解時間3.5 h，溫度 55 ℃，pH9.5，料液比為 1:5（m/V），酶劑量2.5%，將魚鰾提取物進一步懸浮在10倍體積的0.5 mol/L乙酸中，并加入豬胃蛋白酶（20 U / g）。將混合物在4 ℃連續攪拌2 d，得到了約為魚鰾重量8.37%的膠原蛋白。Kaewdang等[20]在提取黃鰭金槍魚魚鰾膠原蛋白的實驗中，用0.5 mol/L含粗胃蛋白酶的乙酸（20單位/g魚鰾），以1:10的固液比在4 ℃條件下提取48 h，膠原蛋白得率高于12.10%。Hong等[23]用中性酶對鰱魚魚鰾蛋白進行水解，酶用量為 1%（w/w，蛋白基），溫度為 45 ℃，pH 為 7.0，最終膠原蛋白得率為18.4%±0.4%。Pal等[7]將鯉魚魚鰾的脫蛋白和脫脂樣品殘留物懸浮在0.5 mol/L乙酸中，含有0.2%胃蛋白酶的乙酸，固液比為1:40（w/v），溫度為4 ℃的條件下水解72 h，產率為61.3%±2.6%。酶法提取魚鰾膠原蛋白的得率普遍較高，可能是因為隨著胃蛋白酶的進一步消化，胃蛋白酶能夠特異性地切割膠原的端肽區，端肽區的交聯分子被切割，從而在進一步提取后提高了產量[21]。此外研究觀察到不同品種的魚鰾膠原蛋白提取率差異很大，這種情況可能是由于原料中膠原纖維的不同交聯所致。

1.2.3 熱水提取法 在一些研究中對于魚鰾膠原蛋白的提取采用了過程簡單、便于操作的熱水提取法，熱水提取法就是原料經過各種前處理后，設置一定的條件用熱水提取其中水溶性膠原蛋白的方法。相較于酸提取法，此方法可獲得具有更高亞氨酸含量的膠原蛋白。周沫希等[24]使用飲用水提取膠原蛋白，在黃唇魚魚鰾和飲用水比例為1:5的條件下，80 ℃煮沸2 h后離心、冷凍干燥得到魚鰾膠原蛋白。涂宗財等[25]按料液比1:3加入草魚魚鰾和0.15%的NaOH浸提1 h，水洗后再按1:3的料液比加0.15%的硫酸溶液，靜置1 h后水洗至中性，最后用80 ℃熱水浸提2 h來提取魚鰾膠原蛋白。此法在提取過程中溫度較高，經過熱處理能夠斷裂膠原蛋白中的氫鍵和一部分共價鍵[26]，使膠原蛋白內部三螺旋結構破壞，便于提取。

1.2.4 其他方法 此外還有鹽提取法、堿提取法、發酵法提取魚鰾膠原蛋白，前兩者在在實際應用中較少，容易引入雜質[27]、提取率和提取純度都不盡人意[28]。微生物發酵法的原理是利用微生物產生的蛋白酶水解魚鰾蛋白，此法可以通過控制發酵時間來獲得不同目的蛋白[29]，其優點是提取成本低、效率高，并且比較其他方法提取得率高[30]，得到的膠原蛋白抗氧化力更強, 使魚鰾產品的營養和功效更加顯著[31]。

1.3 膠原蛋白肽的制備

目前，魚鰾膠原蛋白寡肽的研究相對較少，制備寡肽的原料也是魚的加工副產物，不過為了制備膠原蛋白寡肽，需要采用一系列方法破壞蛋白質的多級結構。當前，魚鰾膠原蛋白寡肽主要采用酶解法制備，因為每種酶都有其固定的酶切位點，針對不同的研究方向可以選擇不同的酶和酶解條件，單一酶解法提取膠原蛋白寡肽可以更好的保留寡肽的活性位點，但其得到的肽段通常比較大。復合酶解法可以得到更小的肽段，從而研究具體發揮作用的小肽段或氨基酸[32]。

研究中常用的蛋白質水解酶包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。為了達到酶的最高活性，制備過程中會提供給酶制劑最適的條件。鄭婷婷[14]設置了底物濃度為3.09%、溫度為50 ℃和pH6.0的條件，加胰蛋白酶酶解草魚魚鰾混合液79.34 min制備魚鰾膠原寡肽粉。李娜等[17]將預處理后的鱈魚魚鰾加入蒸餾水進行勻漿，在pH7.0的條件下按照100 U/mL的酶添加量加入復合蛋白酶，于55 ℃水浴條件下酶解4 h，將酶滅活后，真空旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥得到鱈魚魚鰾膠原蛋白寡肽。Zheng等[33]考察了3種不同的蛋白酶在最適條件下水解黃姑魚魚鰾膠原的效果，酶的用量為1000 U/g，料液比為1:4的混合，酶解4 h。其中中性蛋白酶酶解產物小于1 kDa的膠原蛋白肽具有最好的抗氧化活性。此外，在制備過程中借助超聲波、微波輔助水解可以提高水解效果，分離出更高活性的小肽段[15]。

1.4 膠原蛋白肽的分離純化

膠原蛋白經蛋白酶水解后得到具有不同分子質量的肽段混合物，可通過分離純化技術制備具有特定分子質量區間以及功能活性的寡肽組分。文獻報道常用的分離純化方法有利用透析、鹽析、層析、離心、色譜等方法除去相關雜質，如超濾膜過濾[34]、葡聚糖凝膠色譜柱分離[35]、高效液相色譜分離[36]等。

Ramasamy等[37]將所得的羅虎魚鰾組織進一步用胃蛋白酶處理后，胃蛋白酶溶解的魚膠原蛋白通過鹽析（氯化鈉含量為2.5 mol/L）沉淀法進一步純化。Wu等[38]為比較酸提膠原蛋白和酶提膠原蛋白產物特性，將初產物用0.1 mol/L乙酸透析48 h得到提純產物。Chen等[18]為研究黃姑魚魚鰾中膠原蛋白理化特性，采用了酸提取和酶提取兩種方法，并將初產物用0.57～0.68 mol/L NaCl浸泡后離心，緊接用0.08～0.12 mol/L乙酸和蒸餾水透析1.5～2.3 h得到提純產物。Zheng等[33]以10、5和1 kDa截留膜純化中性蛋白酶水解后的黃姑魚鰾多肽，并進行抗氧化活性評價，結果顯示，小于1 kDa的肽組分具有最高的DPPH自由基清除率。由于魚鰾膠原蛋白肽的研究相對較少，我們可借鑒其他原料提取的膠原肽分離純化方法。Cai等[39]用堿性蛋白酶對草魚皮進行酶解，并通過G-25葡聚糖凝膠色譜柱和反相高效液相色譜對酶解物進行分離純化，得到3種抗氧化活性較高的組分，通過Tof-MS分析確定其氨基酸序列分別為 Val-Gly-Gly-Arg-Pro、Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu和 Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys，分子質量在 480～640 Da之間。Gu等[40]采用超濾膜過濾（截留分子量為10和1 kDa）和反相高效液相色譜來純化從大西洋鮭魚皮酶解產物中分離出的兩種二肽，分別為Ala-Pro和Val-Arg。

文獻報道表明，現有各種分離純化方法可以實現高活性目標組分的富集，但也存在過程時間較長、效率較低且不易得到單組分產物等問題。從開發高附加值產品的角度出發，如何利用新興技術提高分離純化環節的效率、建立具有經濟技術可行性的規模化生產工藝，還應作為今后研究的重點內容。

2 魚鰾膠原肽的功能特性

來源于水產品的膠原蛋白的基本結構為三股螺旋結構，在魚類副產品中發現的主要膠原蛋白是I型膠原蛋白，通常由3條左手螺旋構型α多肽鏈互相纏繞或者兩條α多肽鏈和一條β鏈形成右手螺旋結構，即超螺旋結構，性質比較穩定[41]。當膠原蛋白被降解為分子質量較低的寡肽以后，更易透過腸道被人體吸收，發揮生理功能[42]。

2.1 抗氧化特性

含有不成對電子的自由基在生命活動中發揮著重要的作用。由于自由基非常活躍，其可通過奪取電子（氧化過程）引發一系列有害健康的反應。研究表明，過量的自由基會對生物體造成破壞，如細胞破壞[43]、臟器損傷[44]、皮膚老化[45]等，并導致多種疾病的發生。因此，開發和利用高效無毒的天然抗氧化劑——自由基清除劑對維護人體健康、預防疾病意義重大。

根據以上的研究，驗證了魚鰾膠原肽具有抗氧化活性，并且抗氧化膠原肽的相對分子質量為0.2～1.0 kDa，大多數抗氧化肽都具有低分子量分布，但抗氧化活性有待進一步提高，構效關系有待進一步明確研究。

2.2 抗衰老活性

衰老是生命體必然發生的現象。隨著年齡的增長，生命體的器官或組織的形態結構和生理功能會出現生理性衰退。以皮膚為例，皮膚衰老作為機體整體衰老的一部分具有特殊意義。由于皮膚中纖維蛋白陽性結構的缺失，同時皮膚Ⅰ型膠原蛋白和VII型膠原蛋白含量下降，導致皮膚表皮和真皮之間連接松散，使皮膚變得不規則且無組織[47]。在機體進行正常的生命活動時，自由基和活性氧（ROS）會在新陳代謝過程中通過一些相互關聯的反應生成[48]。在眾多的關于衰老的學說或理論中，自由基和活性氧（ROS）的過量產生被認為是衰老的主要原因，因為它們可以導致DNA、蛋白質和脂質的累積損傷，致使大量的細胞凋亡和細胞壞死。

通過研究發現，從魚鰾中提取的膠原蛋白寡肽具有一定的抗衰老活性。李娜等[17]研究了鱈魚魚鰾提取的生物活性肽的抗衰老活性，通過建立氧化誘導的細胞衰老模型，通過細胞存活率、ROS含量、SA-β-GAL染色和細胞凋亡率的分析，評價其對細胞衰老的影響[49]。實驗水解產物利用G-15葡聚糖凝膠色譜柱純化得到了膠原蛋白寡肽，并且主要由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸組成，同時有較高含量的酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸。作者用不同濃度（100和400 μg/mL）的寡肽培養細胞，隨后用0.2 mmol/L H2O2誘導（過氧化氫誘導的細胞會過早衰老）[50]。結果顯示與正常細胞相比模型組活性有所下降，但實驗組分的細胞活性均高于70%，細胞內ROS含量下降30%以上，高濃度的寡肽可使細胞衰老率和凋亡率降低50%以上。Zheng等[33]研究了日本黃姑魚魚鰾制備的膠原蛋白肽SNNH-1對人臍靜脈內皮細胞ROS水平的影響；H2O2處理后，人臍靜脈內皮細胞的熒光強度明顯高于對照組；而SNNH-1處理可有效降低人臍靜脈內皮細胞的ROS水平；另外，ROS水平隨著SNNH-1濃度的增加而降低；此研究顯示出天然的生物活性肽對過氧化氫誘導的氧化應激的細胞具有保護作用。

2.3 抗疲勞活性

魚鰾膠原蛋白具有較好的抗疲勞活性。疲勞是身體劇烈運動時產生的一種綜合性生理過程，持續的運動過程使肌肉的耗氧量增加、血糖下降及蛋白質消耗，疲勞最主要的表現是運動耐力的下降，這是反映機體疲勞程度最直接和最客觀的指標。王豐雷等[51]將提取梅魚魚鰾膠原蛋白進行小鼠體內抗疲勞活性實驗，將小鼠按高劑量（200 mg·kg-1.d-1）灌胃魚鰾膠原蛋白4周后，對小鼠負重游泳時間、血清尿素氮、肝糖原和肌糖原的含量進行測定；結果表明，灌胃魚鰾膠原蛋白后的小鼠負重游泳時間延長了91.69%，血清尿素氮含量減少了24.07%，肝糖原和肌糖原的含量分別增加了114.38%和123.81%，均有顯著性提高。周沫希等[24]采用小鼠負重游泳實驗評價墨西哥黃唇魚魚鰾膠的抗疲勞效果，測定其負重游泳時間、血乳酸、肝糖原和肌糖原的含量。結果顯示，相比空白對照組，采用高劑量（2.66 g/kg）的墨西哥黃唇魚魚鰾膠連續灌胃40 d的小白鼠負重游泳時間延長了70.68%，血乳酸含量降低了34.58%，肝糖原和肌糖原的含量分別增加了50.29%和50.63%。

從以上研究結果來看，魚鰾膠原蛋白具有顯著的抗疲勞效果，在抗疲勞食品、保健品或藥品方面具有研究價值，但還需要通過后續大量實驗驗證其具體作用方式和副作用，以達到安全有效的抗疲勞目的。

2.4 其他功能

2.4.1 促進創傷愈合 膠原蛋白具有重要的生物醫學應用，參與骨修復、關節軟骨再生、傷口愈合和止血。特別是促進傷口愈合方面，Chen等[18]通過用NIH-3T3成纖維細胞進行劃痕試驗評估體外傷口愈合率，評價從日本黃姑魚膀胱膠原蛋白中提取的膠原對創面愈合率的影響；與對照組相比，在PSC存在下，傷口劃痕面積顯著減少，并呈劑量依賴性；在PSC 12.5、25和50 μg/mL濃度下的劃痕閉合率明顯高于對照組，而在50 μg/mL的PSC濃度下的劃痕閉合率與50 μg/mL的牛Ⅰ型膠原相似，24 h愈合率達到90%，劃痕幾乎完全閉合；體外傷口閉合實驗結果支持了魚鰾PSC誘導NIH-3T3細胞遷移的結論；在傷口愈合過程中，成纖維細胞的增殖和遷移加速了再上皮化過程，促進了傷口閉合。

2.4.2 預防潰瘍性結腸炎（UC） Lu等[52]采用過氧化氫誘導的腸上皮細胞（IEC-6）氧化應激模型和脂多糖（LPS）誘導的IEC-6細胞炎癥模型評估鯽魚魚鰾胃蛋白酶和胰蛋白酶先后水解的水解液（HCSB）的抗氧化和抗炎活性。經50、100和150 μg/mL HCSB孵育后，細胞存活率分別恢復到61.3%、72%和83.8%。經H2O2刺激后，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性分別下降了31%、45.5%和39.8%。經50、100、150 μg/mL HCSB預處理后，超氧化物歧化酶活性恢復到正常細胞的77.5%、86.3%和92.6%，過氧化氫酶活性恢復到61.1%、72.4%和89.4%，谷胱甘肽過氧化物酶活性恢復到71%、78.7%和86.3%。這些結果表明，HCSB預處理可顯著提高細胞存活率。HCSB不僅可以濃度依賴的方式抑制H2O2誘導的IEC-6細胞活力下降，還能有效緩解氧化應激引起的細胞內抗氧化酶活性下降，且這種作用也具有劑量依賴性。

2.4.3 糖尿病的治療 二肽基肽酶IV（DPP-IV）在血糖代謝中起重要作用， Hong[23]在實驗中采用中性酶對鰱魚鰾蛋白進行水解，肽段WGDEHIPGSPYH及其水解產物IPGSPY被完整地轉運到Caco-2細胞單層。這兩個肽對Caco-2和INS-1細胞的作用均表現出良好的抑制可溶性DPP-IV和促進胰島素分泌的作用。

3 結語

水產養殖及加工業在我國有著巨大的規模和市場，在產業轉型，提倡綠色環保的背景下，水產品的加工副產物如何有效利用是一個關鍵問題。目前，對魚鰾來源的膠原蛋白、生物活性肽的研究尚有不足，雖然取得一定的研究成果，但是在功能性寡肽的構效關系與定向制備、目標產物的高效分離純化、潛在生理功能的挖掘以及應用新興技術提高生產效率等方面還存在廣闊的研究開發空間。