空腸彎曲菌全菌滅活疫苗免疫雞效果評價

魏國昊，崔一芳，郭芳芳，曹曉亞，王 雪，劉彥威，徐福洲

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是一種微需氧、菌體呈弧形或螺旋形的革蘭氏陰性細菌，在人彎曲菌感染中占90%以上[1]。該菌感染人主要引起腹瀉性腸炎，同時與人自身免疫性疾病如吉蘭巴雷綜合征等密切相關[1]；感染家畜主要引起母畜流產、不孕、乳房炎和幼畜腹瀉等[2]；感染家禽后不表現任何臨床癥狀，曾被認為是家禽腸道內的一種共生菌[3]，但卻成為人感染的主要來源。據歐洲統計，人空腸彎曲菌感染病例中60%～80%直接來自污染的禽肉[1]。

鑒于家禽空腸彎曲菌感染在食源性致病菌污染中的重要地位，通過控制家禽帶菌量來降低人感染的風險成為該病原防控的關鍵和研究熱點[4-5]。目前控制家禽空腸彎曲菌感染的研究策略包括疫苗、特異性抗體、益生菌、噬菌體、抗菌肽等[4-6]，其中疫苗研制方向主要有全菌滅活疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗、DNA疫苗、多糖疫苗等[6]，全菌滅活疫苗由于制備簡單、安全性好而被較早用于防控家禽空腸彎曲菌感染。通過口服途徑或不同佐劑乳化后經注射途徑免疫雞，結果顯示對該菌在雞腸道的定植無顯著影響[7]，或攻毒初期可延遲其升至較高的水平[8]。最新研究顯示，利用新型滅活劑過氧化氫(H2O2)和氯化銅(CuCl2)混合物制備的空腸彎曲菌全菌滅活疫苗可較好地保持菌體的形態，誘導產生多種抑菌抗體，且對彎曲菌攻毒所致的恒河猴腹瀉提供83%的保護率[9]。

基于此，本試驗將培養至對數生長中期的空腸彎曲菌NCTC 11168菌株收獲后，利用H2O2與CuCl2混合物滅活空腸彎曲菌，與油佐劑乳化后制備全菌滅活疫苗免疫雞。通過口服攻毒試驗評價該疫苗對空腸彎曲菌在雞腸道內定植的影響，同時測定腸道天然免疫相關的促炎和抗炎細胞因子的表達量變化，以及對腸道絨毛結構的影響，為家禽空腸彎曲菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養條件 空腸彎曲菌參考菌株NCTC 11168(中國疾病預防控制中心張茂俊博士惠贈)劃線接種于Mueller-Hinton (MH，BD Difco公司)瓊脂平板，放入三氣培養箱(CO210%、O25%、N285%)中于42 ℃培養24～48 h，挑取MH平板上單菌落接種于MH肉湯中，傳代2～3次至細菌生長旺盛時備用。

1.2 菌株運動力測定 制備0.4%半固體瓊脂平板，吸取2 μL空腸彎曲菌新鮮培養液豎直插入半固體培養基中，緩慢注入菌液，置于三氣培養箱中培養24 h，通過測定接種部位的細菌生長圈來判定菌株的運動力。

1.3 細菌滅活及檢驗 取培養至對數生長中期的空腸彎曲菌NCTC 11168菌液200 mL，經10 000 r/min離心5 min，棄上清后重懸于100 mL無菌10 mmol/L PBS緩沖液中，加入0.1% H2O2與2 μmol/L CuCl2滅活劑，置于搖床中100 r/min振搖24 h，滅活菌液經10 000 r/min離心5 min后棄上清，重懸于10 mL無菌PBS中備用。分別取100 μL滅活的菌液涂布于MHA平板上和5 mL MHB肉湯中，置于三氣培養箱培養48 h后取出，培養板及培養液中無活菌生長判定為滅活完全。

1.4 全菌滅活疫苗制備 取滅活完全的細菌懸液與油佐劑MONTANIDETM ISA 71 VG(Seppic公司)按體積比3∶7混合乳化，制備成油乳劑全菌滅活疫苗作為免疫用抗原；佐劑對照組利用無菌PBS與同樣的油佐劑按體積比3∶7混合乳化后作為免疫用抗原。

1.5 SPF雞免疫試驗 自北京梅里亞實驗動物中心購買9日齡SPF雞90只，隨機分為3組，分別為全菌免疫組、佐劑對照組和空白對照組，每組30只，飼養至14 d齡進行首次免疫，全菌免疫組和免疫對照組每只雞腿部肌肉注射0.3 mL免疫原，空白對照組不免疫，間隔2周后利用同樣的免疫劑量和途徑進行二免。

1.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 分別于一免前(2周齡)、二免前(4周齡)和攻毒前(6周齡)采集各組雞只血液樣品，分離血清后利用間接ELISA方法測定空腸彎曲菌特異性血清IgG抗體水平。利用超聲破碎的空腸彎曲菌NCTC 11168裂解物作為包被抗原，每孔包被100 μL(5 ng/μL)，含5% BSA的PBS溶液作為封閉液，經預實驗后將所有血清樣品稀釋1 000倍，每孔加入100 μL作為一抗，二抗加入1∶10 000稀釋的HRP-labeled goat anti-chicken IgY (H&L，Abcam公司) 100 μL，洗滌后加入100 μL TMB底物溶液，反應30 min后每孔加入1 mol H2SO4溶液50 μL終止顯色，利用ELISA儀(Synergy H1, BioTek公司)測定OD450值，比較不同組別的血清特異性IgG抗體水平。

分別于攻毒前(6周齡)每組剖殺5只雞，取膽汁樣品利用間接ELISA方法測定空腸彎曲菌特異性膽汁IgA抗體水平。具體方法參照上述血清IgG測定進行，其中膽汁樣品稀釋500倍作為一抗，二抗使用1∶10 000稀釋的HRP-labeled goat anti-chicken IgA (H&L，Abcam公司)。

1.7 空腸彎曲菌口服攻毒試驗 試驗雞口服攻毒空腸彎曲菌及菌落計數參照我們最近發表的文獻進行[10]。試驗雞二免后2周進行空腸彎曲菌口服攻毒試驗，取鑒定具有良好運動力的空腸彎曲菌NCTC 11168菌株新鮮培養物，經1 000倍稀釋后口服攻毒試驗雞，100 μL/只，經菌落計數后攻毒劑量約為6.5×104CFU/只。分別于攻毒前和攻毒后的第1、3、6、10、15 d，每組剖殺5只雞，取盲腸內容物加入MH肉湯重懸(質量/體積比為1∶10)，混懸液經10倍系列稀釋后分別取100 μL涂布于添加選擇性抑制劑(OXOID公司)的MH培養平板上，置三氣培養箱中培養48 h后菌落計數。

1.8 細胞因子轉錄水平測定 利用qPCR方法檢測攻毒前后細胞因子在盲腸組織中的轉錄水平，鑒定空腸彎曲菌免疫和攻毒對天然免疫反應相關因子的影響。檢測的12種細胞因子名稱、引物序列、產物大小及參考序列見表1，引物由上海生工生物技術有限公司合成。于攻毒前和攻毒后的第1 d和10 d，自每組剖殺的5只雞中分別取一段盲腸組織，沖洗后置于RNAlater(Thermo Fisher公司)中，研磨處理后利用RNA提取試劑盒(諾唯贊公司)抽提總RNA，經cDNA合成試劑盒反轉錄為cDNA(Bio-Rad公司)，最后利用iTaq Universal SYBR SuperMix在IQ5 qPCR儀(Bio-Rad公司)上進行測定。qPCR反應體系為20 μL，包括2× iTaq Universal SYBR SuperMix 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL(100 ng)、ddH2O補足至20 μL。反應條件為預變性95 ℃、3 min，循環40個反應(95 ℃、10 s，55 ℃、30 s)。以GAPDH測定的Ct值作為內參，同一組別、同一日齡下各細胞因子測定的Ct值減去對應GAPDH的Ct值，然后將攻毒前的空白對照組作為參考計算差異倍數，最后比較不同組別同一日齡下的差異。

表1 利用qPCR測定細胞因子表達水平的引物信息

1.9 組織病理切片制備 于攻毒前和攻毒后的第1 d和第10 d，自每組剖殺的5只雞中分別取一段盲腸組織，沖洗后置于4%組織細胞固定液(索萊寶公司)中，按照標準程序制備石蠟切片，切片分別經蘇木素和伊紅染色(HE染色)后進行脫水封片，最后通過顯微鏡鏡檢進行圖像采集分析，分別測量盲腸上皮絨毛長度和隱窩深度，比較不同組別間的差異。

1.10 統計學分析 利用GraphPad Prism 8軟件包進行t檢驗及方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 空腸彎曲菌特異性血清IgG與膽汁IgA測定結果 利用空腸彎曲菌全菌裂解產物作為包被抗原，分別檢測一免前(2周齡)、二免前(4周齡)和攻毒前(6周齡)稀釋1 000倍的血清IgG抗體滴度。結果顯示全菌免疫組在3個時間點的OD450值分別為0.03±0.01、1.51±0.20和2.36±0.31，而佐劑對照組和空白對照組所有時間點的樣品測定結果均位于0.01 ～ 0.10(圖1)；攻毒前(6周齡)膽汁IgA測定結果顯示，全菌免疫組、佐劑對照組和空白對照組OD450值分別為0.34±0.09、0.11±0.06和0.13±0.02(圖1)。測定結果顯示全菌免疫組特異性血清IgG與膽汁IgA抗體水平一免和二免后均顯著高于佐劑對照組和空白對照組，提示全菌滅活疫苗免疫雞可誘導產生空腸彎曲菌特異性抗體。

①表示全菌免疫組特異性抗體水平顯著高于佐劑對照組和空白對照組，P<0.05。

2.2 空腸彎曲菌口服攻毒后盲腸內容物菌落計數結果 空腸彎曲菌口服攻毒后不同處理組盲腸內容物菌落計數結果顯示，在攻毒后1 d所有處理組均未檢測到空腸彎曲菌定植，攻毒后3 d全菌免疫組和佐劑對照組空腸彎曲菌定植水平顯著高于空白對照組，而在攻毒后的6 d、10 d和15 d 3個組別之間空腸彎曲菌的定植水平均無顯著差異(圖2)。結果提示研制的全菌滅活疫苗不能抑制或降低空腸彎曲菌在雞盲腸內的定植水平。

①表示攻毒后3 d空腸彎曲菌定植水平高于空白對照組，P<0.05。

2.3 空腸彎曲菌攻毒對雞盲腸內細胞因子轉錄水平的影響 本試驗比較了不同處理組在攻毒前及攻毒后1 d、10 d的盲腸樣品中細胞因子轉錄水平的變化，主要包括天然促炎細胞因子IL-6、CxCLi1、CxCLi2；抗原遞呈細胞促炎細胞因子IL-1β、IL-12、IL-18；T細胞促炎細胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-17F；抗炎細胞因子TGF-β、IL-10；以及炎性免疫反應重要因子iNOS(圖3)。從攻毒前不同組別比較結果看，佐劑對照組IL-6、CxCLi1、CxCLi2、IL-1β、IL-12、IFN-γ、IL-17F、TGF-β和IL-10顯著高于空白對照組，而全菌疫苗免疫組僅IL-6、CxCLi2、IFN-γ、TGF-β和IL-10顯著高于空白對照組；攻毒后1 d佐劑對照組CxCLi2、IL-10和iNOS顯著低于空白對照組，而全菌免疫組與空白對照組無差異；攻毒后10 d佐劑對照組IL-6、CxCLi1、CxCLi2、IL-12、IFN-γ、TGF-β和IL-10顯著高于空白對照組，而全菌疫苗免疫組僅IL-1β、IL-18和IFN-γ顯著高于空白對照組。從同一組別不同日齡比較結果看，IL-6、CxCLi1、CxCLi2、IL-12、IFN-α、IL-17F、TGF-β、IL-10和iNOS攻毒前與攻毒后1 d差異無統計學意義，而在攻毒后10 d轉錄水平顯著上升。

①/②表示在同一日齡下全菌免疫組或佐劑對照組與空白對照組比較，差異有統計學意義(①表示P<0.05；②表示P<0.01)。

2.4 空腸彎曲菌定植對雞盲腸上皮組織的影響 攻毒前和攻毒后1 d和10 d分別制備不同處理組的雞盲腸上皮組織病理切片，通過圖像處理系統測量盲腸上皮絨毛長度和隱窩深度，測量結果顯示不同處理組在攻毒前后不同日齡絨毛長度和隱窩深度均無顯著性差異，提示空腸彎曲菌在雞盲腸內定植對上皮組織無顯著性病理損傷。

3 討 論

全菌滅活疫苗由于制備簡單、安全性好、技術成熟而被較早用于研制降低或控制家禽腸道內空腸彎曲菌定植的預防制劑。研究顯示，利用熱滅活或福爾馬林滅活空腸彎曲菌制備的全菌滅活疫苗通過口服、皮下或腹腔注射途徑免疫雞可部分降低該菌的定植或沒有任何抑制效果[7-8, 11-12]。據報道，利用H2O2作為滅活劑制備的病毒滅活疫苗與福爾馬林或β-丙內酯相比，可更好地保護抗原結構且具有更好的免疫刺激效果[13]；Quintel等[9]利用3% H2O2滅活彎曲菌發現對菌體結構造成損傷，通過優化研制了0.1% H2O2與2 μmol/L CuCl2混合的新型滅活劑來制備彎曲菌全菌滅活疫苗，結果顯示該滅活劑既保持了菌體完整的形態、又具有較好的免疫保護效果。因而本試驗選用這種新型滅活劑制備空腸彎曲菌全菌滅活疫苗，免疫雞可產生菌體特異性血清IgG和膽汁IgA，但對空腸彎曲菌口服攻毒后在盲腸內的定植無顯著抑制效果，與Okamura等[7]報道的利用福爾馬林滅活的空腸彎曲菌滅活疫苗經皮下注射免疫雞結果類似。結果提示疫苗免疫效果可能與免疫劑量、免疫途徑、攻毒劑量、雞品種及日齡等多種因素相關。

研究顯示，利用化學試劑去除法氏囊后，不影響空腸彎曲菌在雞腸道內的定植水平，提示B細胞在影響空腸彎曲菌定植雞腸道方面作用有限[14]。本試驗利用空腸彎曲菌全菌免疫后可誘導高水平血清IgG抗體但不能抑制該菌在雞盲腸內定植，而有研究顯示空腸彎曲菌中某些蛋白誘導的體液免疫在控制該菌定植雞腸道方面發揮重要作用。Hermans等[15]利用全菌裂解物免疫母雞后收獲卵黃IgY，飼喂1日齡肉雞可顯著降低空腸彎曲菌在腸道內的定植。Meunier等[16]利用反向疫苗學自篩選出的免疫活性蛋白中鑒定2種蛋白可顯著降低空腸彎曲菌在雞腸道的定植。研究還顯示黏膜免疫在防控空腸彎曲菌定植方面也具有重要作用，利用乳酸菌載體或其它基質遞送的空腸彎曲菌保護性抗原通過口服途徑免疫雞可顯著提高腸道局部黏膜免疫水平，并顯著降低該菌在腸道內的定植[17-19]。

空腸彎曲菌最初被認為是雞的一種腸道共生菌，但研究顯示其定植雞腸道后同樣可刺激產生炎癥和免疫反應[3]。Mortada等[20]利用空腸彎曲菌口服攻毒雞測定免疫反應顯示，攻毒后3 d盲腸扁桃體中T細胞受到顯著抑制，同時細胞因子表達量顯著下調，而攻毒后14 d脾臟中促炎和抗炎細胞因子均顯著上調，攻毒后21 d盲腸中細胞因子也表達上調。本試驗中攻毒后1 d細胞因子表達水平與攻毒前無顯著差異，而攻毒后10 d表達均顯著上調，與該報道類似。佐劑免疫后可顯著提高部分細胞因子的表達水平，但對該菌的定植沒有影響。

截至目前，尚未有商品化的彎曲菌疫苗用于人或畜禽的免疫防控。人彎曲菌感染的疫苗研制策略主要集中于全菌滅活疫苗、以鞭毛蛋白為主的亞單位疫苗以及莢膜多糖結合疫苗[9, 21]，其中莢膜多糖疫苗由于在肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏菌等的成功而具有較大潛力；Pumtang-on等[6]通過對目前所有報道的雞彎曲菌疫苗進行綜合分析比對，認為以外膜蛋白和ABC轉運結合底物蛋白為代表的亞單位疫苗具有發展為防控彎曲菌感染的潛力。由于目前對彎曲菌感染家禽的定植機制尚不清楚，因而研制防控該菌在家禽腸道內定植的產品仍需繼續深入探索。

利益沖突：無

引用本文格式：魏國昊，崔一芳，郭芳芳，等. 空腸彎曲菌全菌滅活疫苗免疫雞效果評價[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(2)：115-121. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.027