云南玉米穗腐病致病菌鑒定與共生群落分析

吳 畏， 田宇昂， 白宇汐， 梁琳悅， 余 洋， 梁鵬寬，蔣中華， 石海春， 柯永培， 孫 群

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064; 2.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064; 3.四川省農業科學院 國家農業微生物成都觀測實驗站，四川 成都 610066;4.四川農業大學農學院，四川 溫江 611130)

0 引 言

玉米是一種重要的經濟作物，如果因病害大規模減產將可能威脅國家糧食戰略安全。而玉米穗腐病是一種廣泛發生的玉米病害，在亞洲、歐洲、美洲等主要玉米種植區都有報道[1]。一般玉米品種該病發病率為5%～10%，部分易感品種發病率超過50%[2]。該病會使患病玉米的果穗、籽粒等腐爛，種子的發芽率和幼苗的成活率降低[3-4]。該病據報道有多種致病菌，主要為真菌，如鐮孢菌 (Fusariumspp)、曲霉菌 (Aspergi1usspp)、根霉菌 (Rhizopusspp) 等，在不同區域主要致病菌有差異[5-7]，并且也可以導致玉米莖腐病的發生[1,8]。

在中國，引起玉米穗腐病的主要致病菌為鐮孢菌，其中擬輪枝鐮孢菌 (Fusarium verticillioides) 和禾谷鐮孢復合種 (Fusarium graminearumclade) 為廣泛分布的致病種；但在部分省份玉米種植區，串珠鐮孢菌 (Fusarium moniliforme)、層出鐮孢菌(Fusarium proliferatum) 和尖胞鐮孢菌 (Fusarium oxysporum) 等也占有一定優勢[3,9-17]。另外，鐮孢菌屬不同的種產毒能力和毒素類型有差異[18]，對不同玉米品種的侵染能力也不同[15,19-20]，所以防治穗腐病需先明確種植區當地的優勢致病菌。2019年云南省玉米總產量920萬噸[21]，玉米穗腐病可能對當地玉米生產造成的損失不容忽視。然而對云南地區玉米穗腐病的發生情況缺乏報道[13]，其主要致病菌尚不清楚，因此需要對當地玉米穗腐病的主要致病菌進行鑒定。本研究在云南玉米穗腐病害嚴重地區采集染病玉米樣本，所采集樣本品種均為某云南大面積播種的高產品種；品種接種鑒定顯示對大斑病、小斑病、南方銹病等常見作物疾病有較高抗性，但易感穗腐病。因此對該玉米品種發生穗腐病的患病情況進行鑒定，可以表征云南玉米穗腐病害嚴重地區玉米感病的情況。

另外，傳統的研究主要利用分離純化然后培養鑒定的方式來確定致病菌，但是由于大量微生物難以在培養基上純化培養，這種方法往往會低估環境中的生物多樣性[22]，也無法明確致病菌及其共生群落的構成。近年來，以環境中微生物宏基因組DNA 信息為基礎，通過PCR-RFLP[23]、PCR-SSCP[24]、高通量測序[25]等方法來研究環境中微生物的組成成為一種更加便捷、全面、準確的研究方式。另外，由于玉米穗腐病的主要致病菌為真菌[1,5]，并且真菌的核基因組 rDNA的內轉錄區間ITS (internal transcribed spacer) 序列長度適中、進化速率較快，常用于真菌種屬鑒定、分型和多態性研究[26]；所以通過對群落DNA的ITS序列進行測序，獲得的信息可以用來研究玉米穗腐病主要致病菌及其共生真菌群落組成。

本研究通過分離純化、形態學鑒定、致病性測定等傳統的鑒定驗證方法和基于Pacbio Sequel三代測序平臺的SMRT (Single Molecule Real-Time)測序技術的群落組成譜分析兩種方式，來研究云南省玉米穗腐病害嚴重地區玉米所患穗腐病主要致病菌及其共生群落組成；并通過文獻來源的玉米穗腐病致病菌鑒定數據進行空間插值分析來研究中國穗腐病致病菌的分布從而了解該病主要致病菌的流行特征。

1 材料與方法

1.1 玉米樣品

發生穗腐病的玉米樣品于2019年采集自云南省楚雄彝族自治州祿豐縣 (海拔：1 659 m；經緯度：25°N，102°E)，共 10 份，均為完整的新鮮玉米棒。

1.2 主要致病菌的分離純化和形態學鑒定

剝離少量發病部位 (玉米籽粒和穗軸) 的玉米材料，75%酒精浸泡10 s，用0.1%升汞消毒5 min，用無菌水沖洗2次，放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 平板上，于18 ℃下培養7 d，挑取菌落邊緣菌絲于新的PDA平板保存。利用稀釋法進行單胞分離[27-28]。將分離的菌株接種于PDA平板上，18 ℃下培養14 d，觀察菌落形態，并在光學顯微鏡下觀察菌絲和孢子特征，與相關文獻中穗腐病致病菌的描述進行比較。

1.3 主要致病菌的致病性測定

將分離培養于PDA平板上的菌株用打孔器(直徑5 mm) 取菌餅分別接種到相同品種新鮮玉米的穗、籽粒和穗軸，18 ℃套袋培養14 d，觀察發病情況。設置空白對照和重復組。取發病部位的玉米材料，用75%酒精浸泡10 s，再用0.1%升汞消毒3～5 min，用無菌水沖洗2次，放置于PDA平板上，于18 ℃下培養7 d，觀察再次分離得到的菌株和原來接種的菌株是否存在形態學上的差異。

1.4 真菌總DNA提取、ITS序列的擴增和測序

分別從玉米籽粒和穗軸患病部位各取兩份菌落樣本 (取自籽粒的菌落樣本編號為：Z1，Z2；取自穗軸的菌落樣本編號為：B1，B2)。按照E.Z.N.A.?Fungal DNA Mini Kit (OMEGA bio-tek,美國) 試劑盒的步驟說明，提取菌落中的真菌總DNA。對提取到的總DNA采用紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，并采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA完整性檢測。使用ITS序列引物ITS1 (TCCGTAGGTGAACC TGCGG) 及ITS4 (TCCTCCGCTT ATTGATATGC)對獲得的DNA模板進行序列擴增。PCR反應體系為 25 μL，包括 12.5 μL Premix Taq，1 μL 引物 ITS1(10 μmol/L)，1 μL 引物 ITS4 (10 μmol/L)，1 μL 模板 DNA，由滅菌 ddH2O 補至 25 μL。95 ℃ 預變性3min，95 ℃ 變性 30 s，57 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸2 min，反應循環數為30，最后72 ℃延伸8 min。采用Pacbio Sequel三代測序平臺對擴增后的DNA片段進行SMRT (Single Molecule Real-Time) 測序。采用perl腳本根據序列兩端的barcode序列進行分樣，并去除barcode，再根據引物序列將反向互補序列轉置為正向序列。測序公司為上海派森諾生物科技有限公司。

1.5 生物信息學和數據分析

1.5.1 序列過濾及操作分類單元 (OTU) 聚類

序列過濾及聚類這一過程使用Vsearch(v2.13.4_linux_x86_64) 和 cutadapt (v2.3) 軟件進行序列過濾和聚類。首先切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；之后拼接序列并進行質控；去除重復序列。在98%相似度水平對去重后的序列聚類，去除嵌合體；再使用perl腳本(https://github.com/torognes/vsearch/wiki/VS EARCH-pipeline)，過濾質控后序列集中的嵌合體，從而獲得高質量序列；在97%相似度水平對高質量序列聚類，并分別輸出代表序列和OTU表。最后，去除OTU表格中的singletons OTU及其代表序列。

1.5.2 生物信息學分析

物種分類學注釋利用QIIME2 (2019.4) 軟件和UNITE數據庫 (Release 8.0,https://unite.ut.ee/)。采用 QIIME2的 classify-sklearn算法 (https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier)，對每個 OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認參數，使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進行物種注釋。使用去除singleton后的OTU特征表，實現各樣本在門和屬分類水平上的組成分布的可視化，并以柱狀圖呈現分析結果。在每個樣本中篩選序列數＞5的OTU，將這些OTU的代表序列與nr/nt數據庫進行BLAST比對，將同一樣本篩選出的代表序列和數據庫中相似度最高的序列利用MEGA7 (v7.0.26) 共同構建Neighbor-Joining進化樹，并以每個樣本篩選出的OTU對應的全部序列數占總序列數比例作柱狀圖來呈現各樣本在種水平上的主要物種的組成分布。

利用QIIME2 (2019.4) 對OTU的豐度表進行抽平，抽平深度設為最低樣本序列量的95%。通過對抽平后的OTU表格進行統計，獲得每個樣本中的微生物群落在各分類水平的具體組成表。利用QIIME2 (2019.4) 進行Alpha多樣性以及稀釋曲線分析，利用R腳本的VennDiagram包繪制OTU的Venn圖。

1.6 中國玉米穗腐病致病菌分布分析

從30篇已發表的文獻中獲取中國21個省份(包含全部玉米主產區) 的5 483個穗腐病致病菌的分離鑒定結果[2-3,9-17,19-20,29-45]，計算每種致病菌在各省份于全部致病菌中所占比例，并繪制餅狀圖；利用 ArcMap (v10.1) 進行 IDW (Inverse Distance Weighted) 空間插值分析，分析主要致病菌在中國各地區的分布。

2 結果與分析

2.1 主要致病菌的形態學鑒定和致病性測定結果

2019年從云南省楚雄彝族自治州祿豐縣采集玉米感病樣本，病穗呈現出腐爛狀，患病部位籽粒腐爛，葉片表面可見白色菌絲體 (圖1a)。從多個玉米樣本患病部位 (籽粒和穗軸) 分離純化獲得的菌株在PDA培養基上18 ℃培養14 d，菌落平均直徑為31 mm，菌絲呈絲絨狀，在培養過程中菌落表面逐漸由白色變為灰紫色 (圖2a)，培養基背面從無色變為橙黃色、紫色，最終接近黑色。在光學顯微鏡下觀察，小型分生孢子數量多，多鏈生，呈橢圓形或卵形，6～9 μm× 2.5～3 μm；無厚垣孢子；產孢細胞單瓶梗或復瓶梗 (圖 2c,d)。經與郭成[2]，丁夢軍[11]，張婷[40]以及許佳寧[31]的鑒定結果比較，其形態各項指標與擬輪枝鐮孢菌相符。

圖1 玉米穗腐病的田間采樣標本 (a)，致病性測定中表現出的穗部腐爛和籽粒、穗軸上的菌落 (b-d)

將分離得到的菌株接種于同一品種玉米的穗、籽粒和穗軸后，在穗部出現腐爛現象 (圖1b)，籽粒上在接種部位沿籽粒間縫隙出現白色絮狀帶紫紅色的菌落 (圖1c)，穗軸出現紫紅色粉狀菌落 (圖1d)，與采集樣本癥狀相似。將這些菌落中的菌株再次分離接種于PDA培養基，培養一定時間后所得菌落形態與之前分離的菌株一致 (圖2b)，可以認定為同種致病菌。因此，可以確認分離得到了導致樣本玉米發生穗腐病的主要致病菌。

圖2 分離菌株 (a) 和致病性測定中再次分離菌株 (b) 在PDA平板上的菌落形態，光學顯微鏡下小孢子 (c)以及產孢細胞 (d) 形態

2.2 序列過濾與質量控制

4 個樣本 (B1、B2、Z1、Z2) 總體高質量序列數目比例達75.80%，在97%相似度水平對高質量序列聚類，總共得到150個OTU (表1)。單個樣本中有效序列豐度大于1%的OTU數目較少，分別是6(B1)、7 (B2)、4 (Z1)、4 (Z2)。4 個樣本的覆蓋度都達到了0.994以上，稀釋曲線 (圖3a)、Simpson曲線(圖3b) 及Shannon 曲線 (圖3c) 均顯示曲線已經趨于最大值并達到平坦，表明樣本測序數據量足夠大，已經包含了幾乎所有的序列多樣性，足夠反映4個樣本中絕大部分待測真菌物種的遺傳信息。除Z1的OTU數目較少外，B1、B2和Z2的OTU數目沒有顯著性差異；但是Z1和Z2的序列豐度大于1%的OTU均少于B1和B2，說明玉米籽粒患病部位比穗軸患病部位主體菌群的多樣性更低。

表1 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 的序列信息

圖3 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 的稀釋曲線 (a)、Simpson 曲線 (b)、Shannon 曲線 (c) 和Pielou’s evenness曲線 (d)

2.3 主要致病菌及其共生真菌群落主成分分析

由主成分分析 (principal component analysis,PCA) 可知 (圖4a)，取自患病籽粒的樣本Z1和Z2距離接近，和取自患病穗軸的樣本B1、B2距離較遠，且B1和B2間距離較遠。上述情況說明患病籽粒處真菌群落相似性高，且與患病穗軸處真菌群落差異較大；而患病穗軸處真菌群落組成可能受所處環境、位置等因素的影響較大。

圖4 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 基于OTU水平的主要致病菌及其共生真菌群落主成分分析 (a)，以及門 (b) 和屬 (c) 水平的主要致病菌及其共生真菌群落結構

2.4 基于門、屬水平的主要致病菌及其共生真菌群落結構分析

經過序列相似性大于97%水平上的OTU聚類，所有樣本中可識別的真菌可分為2個門 (圖4b)。其中主要為子囊菌門 (Ascomycota)，在B1,B2,Z1,Z2中的豐度分別為 99.842%，87.816%，91.377%，98.418%。擔子菌門 (Basidiomycota) 所占比例極少，只在B1中檢出，豐度為0.070%。

在屬水平上4個樣本中的真菌共鑒定出19個屬 (圖4c)。B1中鑒定出15屬，豐度大于1%的有4個，由大至小依次為毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified) (76.464%)、鐮孢菌屬 (Fusarium)(19.581%)、籃狀菌屬 (Talaromyces) (1.384%) 以及德巴利酵母菌科 (Debaryomycetaceae Unclassified)(1.068%)。B2中鑒定出15屬，豐度大于1%的有4個，依次為毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified)(47.468%)、葡萄球菌屬 (Sarocladium) (18.592%)、鐮孢菌屬 (Fusarium) (13.884%) 以及德巴利酵母菌科(Debaryomycetaceae Unclassified) (5.736%)。Z1中鑒定出11屬，豐富度大于1%的有3個，依次為鐮孢菌屬 (Fusarium) (86.313%)、德巴利酵母菌科(Debaryomycetaceae Unclassified) (2.413%) 和毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified) (2.215%)。Z2 中鑒定出15屬，豐富度大于1%的有4個，依次為鐮孢菌屬 (Fusarium) (64.517%)，德巴利酵母菌科(Debaryomycetaceae Unclassified) (23.774%)，毛殼菌科 (Chaetomiaceae Unclassified) (7.991%)，以及葡萄球菌屬 (Sarocladium) (1.543%)。

在B1，B2中，毛殼菌科的豐富度占絕對優勢；而在Z1，Z2中，鐮孢菌屬的豐富度占絕對優勢。對于4個樣本而言，鐮孢菌屬、巴利酵母菌科和毛殼菌科均占優勢 (豐度＞1%)。此外，諸如青霉屬(Penicillium)， 糞 殼 菌 綱 (Sordariomycetes Unclassified)，盤菌亞門 (Leotiomycetes Unclassified)以及子囊菌門 (Leotiomycetes Unclassified) 皆以不同比例 (豐度＜1%) 存在于樣本中。剩余屬則數目極少 (豐度＜0.1%)。另外也存在部分特殊情況，例如在B1中豐富度較高的籃狀菌屬 (1.384%) 在B2與Z1中豐富度均較低 (豐度＜1%) 甚至不存在于Z2中。

2.5 基于種水平的主要致病菌及其共生真菌群落結構分析

4 個樣本 (B1、B2、Z1、Z2) 各自篩選出的主要OTU分別在利用ITS序列構建的進化樹上 (圖5)與擬輪枝鐮孢菌 (Fusarium verticillioides)、彎曲單胞瓶霉 (Phialemonium curvatum)、季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma caribbica)、Cornuvesica falcata、Sarocladium kiliense、艾米斯托克籃狀菌(Talaromyces amestolkiae) 聚為一群，由此可以將這些OTU對應的全部序列歸入對應的種，計算各個種 (主要種) 的相對比例。根據4個樣本中真菌主要種的相對比例 (圖6)，可以看出真菌主要種在4個樣本中的存在比較穩定。其中擬輪枝鐮孢菌、彎曲單胞瓶霉、季也蒙畢赤酵母在4個樣本中都有一定量分布；Cornuvesica falcata在除B1 (圖6a) 外的3個樣本中有一定分布；Sarocladium kiliense在B2和Z2 (圖6b,d) 中有一定分布。特別的是：艾米斯托克籃狀菌僅在來自玉米穗軸的樣本 (B1,B2)(圖6a,b) 有一定分布；彎曲單胞瓶霉在來自玉米穗軸的樣本 (B1,B2) (圖6a,b) 中的相對比例顯著高于來自玉米籽粒的樣本 (Z1，Z2) (圖6c,d)；擬輪枝鐮孢菌在來自玉米籽粒的樣本 (Z1，Z2) (圖6c,d)中的相對比例顯著高于來自玉米穗軸的樣本 (B1,B2) (圖6a,b)。總之，主要種在不同患病部位的真菌群落組成相似，但是相對比例有較大差異。特別的是，彎曲單胞瓶霉作為在環境中廣泛分布的單胞瓶霉屬 (Phialemonium) 的一種真菌[46]，在來自玉米穗軸的樣本 (B1,B2) 中的豐度高于主要致病菌擬輪枝鐮孢菌，可能由于擬輪枝鐮孢菌的侵染干擾了局部微生物群落平衡導致其在患病部位的大量增殖。

圖5 從穗軸所取菌落樣本B1 (a)、B2 (b) 和從籽粒所取菌落樣本Z1 (c)、Z2 (d) 中主要OTU構建的系統進化樹 (圖中相同顏色歸為同一個種)

圖6 從穗軸所取菌落樣本B1 (a)、B2 (b) 和從籽粒所取菌落樣本Z1 (c)、Z2 (d) 中主要真菌 (種水平) 的相對比例

2.6 主要致病菌及其共生真菌群落的Alpha多樣性和Venn圖分析

Alpha多樣性指數可以用來表征各樣本內真菌群落多樣性 (表2)。其中Chao1、Observed species指數為預估群落豐度的指數，數值越大，則說明樣本內菌群豐度越高；Simpson、Shannon指數則用來表征群落多樣性，指數越大，群落多樣性越高；以Pielou’s evenness指數表征均勻度；以 Good’s coverage指數表征覆蓋度，其數值越高，則樣品中序列被測出的概率就越高，檢測結果對樣本中微生物的真實情況的代表性越高。

表2 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 的Alpha多樣性指數

Alpha多樣性分析結果表明，從同一患病部位(籽粒或穗軸) 獲取的兩個樣本 (Z1和Z2，B1和B2)間的真菌群落豐度和多樣性都有顯著差異，這可能是取樣位置等因素的不同帶來的差異；在同一豐度水平 (Chao1、Observed species指數均接近) 的兩個樣本B1和Z2之間，Z2的Simpson、Shannon指數均高于B1，說明取自籽粒患病部位的真菌群落多樣性高于穗軸，即主要致病菌的共生真菌群落組成在不同患病部位具有差異。

由 Venn圖 (圖 7a)，在 4個樣本主要的 61個OTU中，僅有10個共有OTU，占比為16.39%；除Z1外，Z2、B1、B2分別有 6、8、7個獨有 OTU。說明不同植株不同患病部位 (籽粒或穗軸) 的真菌群落組成整體相似度不高。由Venn圖各區域屬水平的OTU豐度組成 (圖7b) 可以看出，四個樣本共有OTU豐度最高的為鐮孢菌屬，與主要致病菌為擬輪枝鐮孢菌的結論相符。

圖7 從穗軸和籽粒所取菌落樣本 (穗軸: B1、B2,籽粒: Z1、Z2) 中主要致病菌及其共生真菌群落的Venn圖 (a) 及Venn圖不同區域的OTU豐度柱狀圖 (b)

2.7 中國玉米穗腐病主要致病菌的分布

中國主要玉米產地 (省份) 玉米穗腐病的主要致病菌為鐮孢菌屬，且涉及具體種數目多 (＞15)，但是大部分僅在有限的地區零星分布 (圖8a)。其中在較多省份有較高比例的種有 (圖8b-f)：擬輪枝鐮孢菌 (Fusarium verticillioides)、串珠鐮孢菌 (Fusarium moniliforme) 、禾谷鐮孢復合種 (Fusarium graminearumclade)、層出鐮孢菌 (Fusarium proliferatum) 和尖胞鐮孢菌 (Fusarium oxysporum)。擬輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢復合種在中國主要玉米產地均有分布；前者在中國北方和海南省占有優勢地位，后者在山西、陜西、黑龍江、云南等省份占有較大比例。串珠鐮孢菌、層出鐮孢菌和尖胞鐮孢菌在中國的分布相對局限；串珠鐮孢菌主要分布于四川省和山西省，層出鐮孢菌主要分布于中國中部省份，尖孢鐮孢菌主要分布于重慶市和云南省。另外，青霉 (Penicilliumspp)、毛霉 (Rhizomucorspp)、曲霉 (Aspergillusspp)、木霉 (Thichodermaspp) 等也在有限的地區少量分布。上述結果表明鐮孢菌屬各種在中國呈現出一定的區域性分布趨勢，總體上擬輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢復合種在中國主要玉米產區占優勢，與之前的結論一致[9-10,13,33,35-36,44]，但是在中國北方地區優勢更明顯；在中國中部和南方地區鐮胞菌屬致病種整體多樣性更高，串珠鐮胞菌、層出鐮胞菌等集中分布。

圖8 中國玉米穗腐病致病菌分布 (a)，以及擬輪枝鐮孢菌 (b)、串珠鐮孢菌 (c)、禾谷鐮孢菌 (d)、尖孢鐮孢菌 (e)、層出鐮孢菌 (f) 在中國的分布

3 結束語

本研究通過形態學鑒定和三代測序群落結構分析鑒定出云南省發生嚴重玉米穗腐病害地區的玉米穗腐病主要致病菌為擬輪枝鐮孢菌，并解析了其共生真菌群落結構。擬輪枝鐮孢菌共生真菌群落多樣性較高但彎曲單胞瓶霉、季也蒙畢赤酵母、Cornuvesica falcata、Sarocladium kiliense、艾米斯托克籃狀菌等少數真菌在不同患病部位穩定存在，可能與其存在穩定的互利關系。另外，鐮孢菌屬優勢種的分布可能與玉米品種和氣候條件有關[32,42]。本研究通過搜集到的文獻數據進行分析發現，雖然擬輪枝鐮孢菌在中國幾乎所有玉米產區都可以分離出，但仍有傾向于分布在中國北方地區 (如遼寧、甘肅等省份)的趨勢，這與擬輪枝鐮孢菌偏好干燥炎熱的氣候的結論一致[47]；而其在相對濕熱的云南省分布并在部分地區發生嚴重的穗腐病害，可能是當地易感穗腐病的玉米品種的廣泛播種和現代發達的物流導致其在大范圍地域間遠距離擴散的結果。除此之外，由于玉米莖腐病和穗腐病致病菌組成高度相似且同源[8,48]，這兩種病害的差異可能是相似的致病菌和共生微生物群落空間分布不同導致的，因此本研究的結果對進一步研究穗腐病、莖腐病等病害的主要致病菌和其共生群落組分間的互作奠定了基礎，并對玉米穗腐病、莖腐病等病害在云南當地乃至全國的防治工作以及相應抗病玉米的選育有指導意義。