LC-MS/MS法檢測櫻桃和土壤中抗灰霉病農(nóng)藥殘留

周 冰， 安國榮， 朱 琳， 閻 娥

(1.青海省地質(zhì)礦產(chǎn)測試應(yīng)用中心，青海 西寧 810000; 2.青海師范大學(xué)，青海 西寧 810000)

0 引 言

櫻桃是我國營養(yǎng)價(jià)值很高的特色水果之一。它屬于薔薇科櫻桃屬落葉果樹，因含有微量維生素B族、C族及鈣、磷等元素，具有極高的食用價(jià)值[1]。果農(nóng)在栽培櫻桃樹時(shí)存在成活率偏低，容易受到病原菌侵害的問題，果實(shí)顯得稀少而珍貴。加上，市場需求量巨大，果農(nóng)對櫻桃樹栽種面積日益擴(kuò)大，而櫻桃樹的根癌病卻限制了其高產(chǎn)。迄今為止，運(yùn)用化學(xué)殺菌劑防治灰霉病仍然是生產(chǎn)中最主要的手段之一，其具有效果快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，易使果農(nóng)種植產(chǎn)生使用依賴性，存在濫混濫用，造成農(nóng)藥殘留問題[2-3]?；颐共》乐问褂玫默F(xiàn)代殺菌劑種類非常多，大致概括為七大類：苯并咪唑類，其代表有多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈、苯菌靈；N-苯基氨基甲酸酯類，其代表有乙霉威；二甲酰亞胺類，主要代表有異菌脲；苯胺基嘧啶類，代表有嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺等；異噁唑啉類，代表有啶菌噁唑、丁吡嗎啉和丁香菌酯等；甲氧基丙烯酸酯類，主要代表有嘧菌酯；琥珀酸脫氫酶抑制劑代表有氟吡菌酰胺、吡噻酰胺等[4-6]。啶菌噁唑?qū)Ψ鸦颐共《?、葉霉病菌等具有很強(qiáng)的抑制作用以及植物預(yù)防、治療活性和內(nèi)吸、傳導(dǎo)的作用，主要表現(xiàn)為抑制灰霉病菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長及芽管伸長，其具有廣譜和突出的離體殺菌活性被廣泛應(yīng)用。然而，肆意使用現(xiàn)代農(nóng)藥不僅對土壤和水源造成污染，也會間接影響包括人類在內(nèi)的非靶標(biāo)生物[7-10]。Wei[11]等通過研究檢測土壤中的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留物，發(fā)現(xiàn)該農(nóng)藥殘留物可以在不同的田間相互轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)氯農(nóng)藥竟然可以在土壤中殘留 25年之久。因此，為了保障農(nóng)作物的安全必須開展土壤環(huán)境中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測 [12]。

目前，對于這幾種農(nóng)藥殘留的檢測，相關(guān)研究主要還是以番茄、茄子、蘋果等常規(guī)水果蔬菜為對象，以研究農(nóng)藥降解的半衰期，對食品檢測機(jī)構(gòu)對農(nóng)藥殘留控制的支持非常有限。另外，在農(nóng)藥殘留的檢測方法研究上，大多數(shù)方法仍采用常規(guī)的氣相色譜、液相色譜等，其檢測限一般較高，無法真正滿足食品檢測監(jiān)控的需求[13]。涉及同時(shí)檢測土壤和種植果蔬中殘留的方法報(bào)道非常少，兩者同時(shí)作為研究對象，不僅能夠有效監(jiān)控土壤中農(nóng)藥的殘留，指導(dǎo)合理用藥，而且可以進(jìn)一步保障農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。因此，開發(fā)出靈敏、高效的多組分農(nóng)藥殘留分析方法，來檢測土壤和本體中這些化合物的實(shí)際殘留水平成為十分迫切的需求。本研究旨在建立一種抗灰霉病農(nóng)藥在櫻桃和土壤中的殘留分析方法，為農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測提供保障，也為其他種類的農(nóng)藥在土壤環(huán)境中的檢測分析方法開發(fā)提供借鑒[14]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB-SCIEX公司，SCIEX-4500TRAP）；液相色譜柱（資生堂公司，CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18，100 mm×2.0 mm，3 μm）；可變速高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)（北京飛馳科學(xué)儀器有限公司，PULVERISETTE 14）；均漿機(jī)（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司，T25）；紫外分光光度計(jì)（上海讓奇儀器有限公司 UV1900）；高速冷凍離心機(jī)（美國THERMO公司，TJ-140）；高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 BUCHI公司，R-300）；MCX 固相萃取柱（華譜生物，HPSW C18-6 mL）。

啶菌噁唑（≥99.0%）、乙霉威（≥98.0%）、噻菌靈（≥98.0%）、嘧菌酯（≥99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma；色譜純乙腈，購自阿拉丁試劑公司；分析純乙腈、甲醇、甲酸溶劑購自麥克林試劑公司；氯化鎂、無水硫酸鈉均購自國藥。

1.2 溶液配制

1.2.1 樣品前處理

1）采樣和樣品制備

供試品櫻桃和土壤樣品采集自山東省新泰市天寶鎮(zhèn)櫻桃種植基地。從每個(gè)種植園中隨機(jī)選取15個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣從10 cm深度挖取100 g左右的土樣，置于樣品袋中。土壤樣品不用風(fēng)干，直接過1 mm篩后，于4 ℃保存，備用。櫻桃采集自不同的樹苗，取出內(nèi)核后，將果肉切成小段,勻漿后，取 400 g 左右樣品裝入玻璃瓶中，于4 ℃保存，備用。

2）提取

分別稱取5 g均質(zhì)后的櫻桃和過篩后的土壤樣品于 100 mL聚乙烯塑料離心管中，加入5 mL純凈水?dāng)嚢杈鶆?，充分混合，加?5 mL的乙腈進(jìn)行振蕩后待靜置分層。然后依次加入 1.5 g無水硫酸鈉和1.5 g氯化鎂，鹽析振蕩5 min，用管式離心機(jī)在8 000 r/min下離心5 min；移液槍移取上清液到100 mL 容量瓶中，用分析乙腈定容至 100 mL，備用。

3）凈化

依次流加 5 mL 乙醇和5 mL 高純水在MCX固相萃取柱中進(jìn)行充分活化。然后移取5 mL上清液過柱，再依次用 5 mL 高純水和5 mL 乙醇洗滌,真空抽干后，用 20 mL 5%氨水乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液收集于單口瓶中，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入約2 mL 的乙腈：0.2% 甲酸銨溶液 (8∶2,V∶V)振蕩溶解 2 min，然后用針筒過0.22 μm 有機(jī)系濾膜，收集待檢。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙腈溶解；置于100 mL棕色容量瓶中，配成1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品母液，備用。使用時(shí)將4種母液按比例用乙腈稀釋，分別制得 8個(gè)濃度梯度（0.000 1，0.000 2，0.000 5，0.001 0，0.002 0，0.003 0，0.005 0，0.010 0 mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用錫箔紙包裹，于–18 ℃避光保存。

1.3 儀器條件

1）液相條件：

CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色譜柱 (100 mm×2.0 mm,3 μm)；柱溫為 45 ℃；樣品室溫度為 10 ℃；流量 0.2 mL/min；進(jìn)樣量 5 μL；采用梯度洗脫方式，條件為 0 min，90% A，10% B；3 min，50% A，50% B；4 min，20% A， 80% B；5 min，90% A，10% B；6 min，100% A，0% B。A代表0.2%甲酸溶液，B代表乙腈。

2）質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧（ESI）；采用電壓為 4.5 kV的正離子模式；離子源為 148 ℃；干燥氣采用氮?dú)?，氣體流量為 800 L/h；溫度設(shè)定為600 ℃；碰撞氣采用氬氣，真空為 2.5×10–4kPa。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分別考察高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)條件、樣品提取條件、凈化劑的選擇條件等對分析方法的影響，然后進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)包括檢測線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢測限確認(rèn)和回收率、精密度，最終以真實(shí)樣品進(jìn)行定量檢測以確定方法的可行性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件優(yōu)化

由于啶菌噁唑、乙霉威、噻菌靈、嘧菌酯的極性差異性，它們對色譜柱和流動相具有選擇性，分別以 Accucore? Vanquish? C18+色譜柱 (100 mm×2.0 mm,3 μm)和 CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18 色譜柱(100 mm×2.0 mm,3 μm)比較考察對4種農(nóng)藥的選擇性影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同色譜條件下，4種農(nóng)藥在Accucore? Vanquish? C18+色譜柱上無法實(shí)現(xiàn)完全分離，并且嘧菌酯峰型有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。而在CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色譜柱上4種農(nóng)藥均可以保留，實(shí)現(xiàn)完全分離。且啶菌噁唑在CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色譜柱相比 Accucore? Vanquish?C18+色譜柱上的峰型有更好的對稱度，因此，確定CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18作為分離色譜柱。

本實(shí)驗(yàn)分別使用乙腈、甲醇、乙腈–0.2%甲酸、甲醇–0.2%甲酸4種溶液篩選流動相條件，而梯度洗脫條件相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入甲酸的混合流動相組，峰型明顯更為尖銳，說明加入微量甲酸可以起到改善峰型和待測物組分的離子化的作用，待測物組分的響應(yīng)值明顯更高。洗脫溶劑選擇方面，流動相甲醇相較于乙腈，洗脫效果要差些，各待測物峰型較差且出峰時(shí)間延后。因此，以乙腈–0.2%甲酸水溶液作為流動相是更好的選擇。優(yōu)化后的色譜圖見圖1、圖2。通過對樣品的正、負(fù)離子模式下的母離子全掃描，我們發(fā)現(xiàn)正離子模式下的全掃描有更高的響應(yīng)值，各峰型參數(shù)見表1。因此，確定在正離子模式進(jìn)行掃描得到目標(biāo)物的分子離子峰，然后，以一定能量的氣體撞擊母離子，全掃描后得到二級離子，選取適合檢測的二級離子作為定性和定量的離子分析。最后，優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，獲得質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化后的4種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)結(jié)果見表2。可以看出 4種農(nóng)藥色譜峰峰形較好，各峰型間的分離度均大于1.5。

圖1 4種農(nóng)藥殘留在土壤中的典型TIC圖

圖2 4種農(nóng)藥殘留在櫻桃中的典型TIC圖

表1 4種農(nóng)藥色譜數(shù)據(jù)表

表2 4種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)1）

2.2 提取條件優(yōu)化

通過查閱文獻(xiàn)[15]，參考樣品前處理?xiàng)l件，本實(shí)驗(yàn)分別對比了甲醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃溶劑對提取效果的影響，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇和乙腈提取效果沒有明顯的差異，均能滿足殘留分析的要求，啶菌噁唑和噻菌靈使用乙腈的提取回收率稍高于甲醇，而使用丙酮和四氫呋喃提取液有一定的渾濁，對4種農(nóng)藥殘留分析有一定的影響，回收率均低于80%。通過對4種溶劑的極性比對發(fā)現(xiàn)，乙腈＞甲醇＞丙酮＞四氫呋喃，根據(jù)極性相似相溶原理，判斷這4種農(nóng)藥極性與乙腈最為接近，因此，乙腈是最為理想的提取溶劑。

表3 不同提取溶劑對回收率的影響

2.3 凈化劑優(yōu)化

凈化劑能夠有效去除脂肪酸、有機(jī)酸和一些極性色素及糖類，甚至是一些極性成分也能夠有效去除。本實(shí)驗(yàn)分別選用凈化劑N-丙基乙二胺、弗羅里硅土及石墨化炭黑對凈化效果的影響。農(nóng)藥檢測回收率影響結(jié)果見圖3和圖4。不同凈化劑對檢測信噪比影響結(jié)果見圖5。

圖3 不同凈化方式對櫻桃回收率的影響

圖4 不同凈化方式對土壤回收率的影響

圖5 不同凈化方式對櫻桃農(nóng)藥殘留信噪比的影響

分別采用三種不同的凈化劑處理，經(jīng)過處理后明顯發(fā)現(xiàn)上清液澄清，說明采用三種凈化劑處理都能夠有效地去除色素，通過回收率驗(yàn)證，櫻桃和土壤中4種農(nóng)藥的殘留回收率在94%～109%，說明均能滿足檢測的需要，各組間的回收率差異性不大。通過信噪比可以間接地反映檢測的靈敏度，其中弗羅里硅土和N-丙基乙二胺相對信噪比更高，說明在液相中有更高的響應(yīng)值，檢測靈敏度更高，從經(jīng)濟(jì)性上考慮，選擇弗羅里硅土作為凈化劑更為合適。

2.4 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢測限

通過配置不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線來評估方法的線性范圍及其相關(guān)性。以信噪比S/N=3 計(jì)算檢出限，不同標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸參數(shù)見表4。

表4 4種農(nóng)藥的檢測線性參數(shù)

從表4可以看出，4種農(nóng)藥在 0.000 1～0.001 0 mg/L濃度范圍內(nèi)，本方法的線性回歸系數(shù)r2均大于0.993，說明在該范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能滿足檢測要求。啶菌噁唑檢測限最低，優(yōu)于其他3個(gè)農(nóng)藥1～2個(gè)數(shù)量級，說明其檢測響應(yīng)值最高，能得到更為精密的檢測結(jié)果。在該檢測范圍內(nèi)，對4種農(nóng)藥殘留的檢測限均達(dá)到了納克級別，均能夠滿足食品檢測標(biāo)準(zhǔn)需要。

2.5 回收率和精密度

為了滿足不同濃度下4種農(nóng)藥的檢測的需求，分別以櫻桃和土壤樣品為基質(zhì),在 0.000 1，0.001 0，0.010 0 mg/kg 3 個(gè)濃度梯度水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率驗(yàn)證,結(jié)果如表5 所示。

表5 4種農(nóng)藥在櫻桃及土壤中加標(biāo)回收率驗(yàn)證（n=3）

結(jié)果表明，4種農(nóng)藥檢測的平均回收率為82.44%～104.54%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 2.19%～4.92%，結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)。當(dāng)濃度0.000 1 mg/kg＜C≤0.0010 mg/kg時(shí)，回收率均在82.44%～99.43%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.33%，當(dāng)濃度0.001 0 mg/kg＜C≤0.010 0 mg/kg時(shí)，回收率均在87.37%～104.54%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.92%。因此，該檢測方法準(zhǔn)確可靠，適用于櫻桃及其土壤中啶菌噁唑等殘留分析。

2.6 實(shí)際樣品定量分析

分別采集櫻桃種植基地的櫻桃和土壤樣品10份，分別稀釋至檢測濃度范圍，按照1.2.1樣品前處理后，分別檢測，檢測結(jié)果見表6。

表6 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

從采集樣品的檢測數(shù)據(jù)來看，櫻桃中殘留的啶菌噁唑等4種農(nóng)藥均低于正常要求的控制限度（0.5 μg/kg），說明產(chǎn)品農(nóng)藥殘留達(dá)到質(zhì)量控制要求。另外，產(chǎn)品櫻桃中的農(nóng)藥殘留量總體上要低于土壤中的農(nóng)藥殘留量。本方法對啶菌噁唑和噻菌靈有較高的檢測靈敏度，盡管櫻桃中噻菌靈和啶菌噁唑殘留量分別為 0.16 μg/kg和 0.08 μg/kg，但土壤中噻菌靈和啶菌噁唑殘留量較高，分別達(dá)到了9.47 μg/kg和13.42 μg/kg，說明這兩種物質(zhì)不容易分解，長期噴灑后會造成在土壤累計(jì)，存在一定的安全隱患。需要加強(qiáng)監(jiān)管，要求其降低農(nóng)藥的使用量。國家在對啶菌噁唑類農(nóng)藥使用劑量規(guī)范上需要建立2套使用控制標(biāo)準(zhǔn)，以符合環(huán)境控制要求。

3 結(jié)束語

本研究建立LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，可以用來檢測水果及土壤中啶菌噁唑等農(nóng)藥殘留，并完成了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法具有良好的專一性，廣泛的線性，運(yùn)行時(shí)間短，定量限低，可以為特殊高品質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供方法參考，為農(nóng)產(chǎn)品的安全用藥提供雙重保障，解決了傳統(tǒng)的單一檢測產(chǎn)品農(nóng)藥殘留或監(jiān)控滯后造成土壤污染的問題，是一種適合推廣的農(nóng)殘監(jiān)測方法。本分析方法可以適用在灰霉病防治農(nóng)藥殘留的檢測，我們知道在現(xiàn)如今病蟲害多發(fā)的環(huán)境中，復(fù)合農(nóng)藥的使用增加了國家監(jiān)測的負(fù)擔(dān)，在本研究中的分析方法并未對常規(guī)農(nóng)藥如氟吡菌酰胺、吡噻酰胺等的檢測開展相關(guān)工作，對于國家關(guān)注的擬除蟲菊酯、有機(jī)氯等農(nóng)藥殘留檢測上的適用性也有待進(jìn)一步確認(rèn)。