基于Nrf2-ARE信號通路探討加味丹參飲對心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機制

張 姚,譚 琦,戴垠坤

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 長沙 410000)

在危及到人類健康的眾多疾病當(dāng)中,缺血性心臟病是較為常見的,讓血流恢復(fù)再灌注是最根本的治療方法。但是當(dāng)恢復(fù)血流再灌注之后,患者卻面臨著更嚴(yán)重的心肌損傷情況,人們稱此種情況為心肌缺血再灌注損傷(IRI)。當(dāng)前在醫(yī)療技術(shù)得到快速發(fā)展的情況下,臨床上也開始應(yīng)用各種新的治療方法和技術(shù)[1]。其中中藥對于IRI疾病的干預(yù)相關(guān)研究也吸引了不少學(xué)者的關(guān)注。在本次研究中就分析了加味丹參飲在IRI疾病中的干預(yù)效果,并分析干預(yù)中Nrf2-ARE信號通路所發(fā)生的改變。

1 資料與方法

1.1一般資料：納入30只雄性、性成熟的家兔,清潔級。家兔體重20～30 g。研究中需要使用到的試劑主要有：免疫熒光化學(xué)試劑、一抗、二抗、水合氯醛、萊菔硫烷(Nrf2激活劑)等。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2方法:將30只家兔劃分為三組,每組有10只。

1.2.1空白組：需要與模型組的家兔一樣,注射等量的0.9%NaCl溶液，完成開胸和冠脈穿線不結(jié)扎等。

1.2.2模型組：在兔耳緣靜脈,連續(xù)20 d注射去甲腎上腺素,具體注射劑量為0.1 mg/(kg·d)。在完成造模的第2天,需要注射250 mg/kg牛血清白蛋白。每10天注射1次,共注射2次。以空白組為標(biāo)準(zhǔn),對比兩組血流變學(xué)指標(biāo),當(dāng)模型組的這一指標(biāo)明顯高于空白組,即表示建模成功。

1.2.3干預(yù)組：需要按照成人的使用藥量,以動物的具體體重等完成換算。該組需要讓實驗兔完成灌胃給藥。在開胸之前的3 d,向胃部灌入10 ml/(kg·d)加味丹參飲。這一藥物中包含的中藥具體有：黃芪、丹參各20 g,赤芍10 g,川芎、紅花、當(dāng)歸、檀香等各6 g，還需要12 g的生地黃。將這些藥材進行浸泡和煎煮、濃縮之后,保存好，為之后的應(yīng)用做好準(zhǔn)備。另外還需要讓本組家兔以腹腔給藥的方式,接受1 mg/kg的Nrf2激活劑藥物服用。在手術(shù)之后,1次/d。

1.3評判指標(biāo)：需要對比不同組別中家兔的Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)和凋亡細胞數(shù)量。

1.3.1Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)檢測方法：采用組織免疫熒光檢測方法進行檢測。首先,對心肌組織切片采取冰凍措施,接受PBS漂洗。完成3次,5 min/次漂洗后,在丙酮當(dāng)中固定30 min左右。然后,漂洗后要采用0.25%的Triton液進行15 min的破膜；再采用濃度為10%的BSA進行60 min的封閉。之后開展孵育一抗、二抗,DAPI染色等。在顯微鏡下對陽性細胞的數(shù)量進行觀察。再觀察100倍視野下,從5個不同視野觀察心肌缺血再灌注病灶周圍情況。最后在借助于Optpro方法進行成像分析。

1.3.2檢測心肌細胞凋亡方法：選取研究對象左心室位置的心肌細胞,大小為27 mm3左右,使用濃度為4%的多聚甲醛進行固定。還需要分別使用梯度乙醇、二甲苯、石蠟等完成脫水、透明和包埋,最終進行切片。所選擇的檢測方法為末端探針標(biāo)記方法。凋亡陽性細胞的判定標(biāo)準(zhǔn)為：在細胞核中觀察到棕黃色的顆粒物。圖像分析方法：針對陽性表達情況,開展半定量分析。在分析凋亡細胞數(shù)量時,還要借助于彩色病理圖像來完成,選擇多種結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果：三組研究對象在第3天和第5天的Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果,從表中數(shù)據(jù)看出,干預(yù)后的第3天和第5天,空白組免疫雙標(biāo)陽性細胞分別是(10.0±1.0)個和(11.0±1.0)個；干預(yù)組統(tǒng)計結(jié)果分別為(26.0±1.0)個和(33.0±2.0)個；模型組統(tǒng)計結(jié)果分別為(19.0±2.0)個和(21.0±1.0)個,干預(yù)組家兔該項指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果明顯高于其他兩組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2凋亡心肌細胞統(tǒng)計數(shù)量：三組家兔凋亡心肌細胞的統(tǒng)計數(shù)量,空白組、干預(yù)組、模型組,三組結(jié)果分別為(178.6±36.7)個,(123.5±4.3)個,(291.6±16.7)個。根據(jù)表中數(shù)據(jù)顯示情況,可以發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的凋亡心肌細胞數(shù)量明顯低于模型組,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果個，n=10)

2.3病理學(xué)結(jié)果：模型組和干預(yù)組的家兔心肌組織都接受濃度為5%的多聚甲醛固定,完成包埋、切片以及染色后,在光鏡下進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①模型組：家兔的血管壁當(dāng)中可以很清楚地看到聚集了不少的中性粒細胞,心肌纖維排列相對混亂,著色存在著不均勻情況。還有一些斷裂的心肌纖維,心肌細胞有大片壞死現(xiàn)象。間質(zhì)也能看到比較明顯的炎性細胞浸潤情況。②干預(yù)組：能夠看到中性粒細胞聚集在血管壁當(dāng)中；也出現(xiàn)了心肌纖維排列混亂和著色不均勻情況。與模型組相比,心肌細胞壞死范圍更小；能看到比較少的炎性細胞浸潤情況。模型組和干預(yù)組第5天的病理學(xué)觀察結(jié)果,見圖1～2。

圖1 模型組細胞切片結(jié)果(×100)

圖2 干預(yù)組細胞切片結(jié)果(×100)

3 討論

雖然當(dāng)前冠心病相關(guān)疾病的治療技術(shù)已經(jīng)得到了很大程度的提升,但是冠心病相關(guān)心臟病導(dǎo)致的死亡率和致殘率仍然很高。尤其是當(dāng)患者心肌缺血再灌注時,會給患者本身帶來嚴(yán)重的二次傷害[2]。心肌細胞在缺氧、缺血后,會導(dǎo)致機體生理和病理出現(xiàn)較為復(fù)雜的變化。有更多的鈣離子會進入到線粒體當(dāng)中,危及線粒體的正常功能。當(dāng)機體處于心肌缺血狀態(tài)下,激活炎性反應(yīng),若再灌注,便會讓已經(jīng)出現(xiàn)的心肌炎性反應(yīng)變得更加嚴(yán)重[3]。在病理發(fā)展中,有很多促炎因子被釋放,如IL-6、IL-8以及干擾素等,帶來比之前更嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。這都會成為影響最終治療效果的不利因素[4]。所以,這些年來也有越來越多的學(xué)者開始關(guān)注心肌缺血再灌注的預(yù)防措施和應(yīng)對策略。

3.1Nrf2-ARE對IRI的保護機制：在心血管系統(tǒng)當(dāng)中,Nrf2的表達整體比較穩(wěn)定,也可以起到很好的保護心肌效果。Nrf2-ARE通路在內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答機制當(dāng)中,也起到了十分關(guān)鍵的作用。借助于氧化應(yīng)激作用,能夠讓Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄速度不斷加快,加快形成Nrf2蛋白。再對下游的二相解毒酶基因表達、抗氧化蛋白等起到調(diào)節(jié)作用,減少氧化損傷所帶來的不利影響。雖然當(dāng)前不同學(xué)者對于這一指標(biāo)的表達觀點存在差異,但是對其作用認同度比較高的是：其具有較好的抗氧化應(yīng)激效果。通過Nrf2-ARE通路,不同藥物都可以介導(dǎo)抗IRI,起到保護效果[5]。本研究結(jié)果顯示,干預(yù)組患者在開展了Nrf2激活聯(lián)合加味丹參飲治療之后,患者的Nrf2-ARE雙標(biāo)陽性細胞數(shù)量出現(xiàn)了十分顯著的增加,而且與模型組相比,之間的差異比較顯著。若ROS數(shù)量比較大會對線粒體氧化磷酸化的持續(xù)作用起到抑制,降低了合成能量的數(shù)量。當(dāng)心肌細胞再灌注處于早期階段時,會降低抗氧化酶的活性以及所釋放的氧自由基,最終會讓心肌細胞產(chǎn)生嚴(yán)重的受損情況[6]。而Nrf2-ARE信號通路,則可以對氧化反應(yīng)和炎性反應(yīng)都起到相應(yīng)的抑制作用,減少ROS的數(shù)量。

3.2加味丹參飲對IRI的改善機制：在冠心病的發(fā)展過程中,心肌IRI是其中的一個構(gòu)成環(huán)節(jié)。基于中醫(yī)視角來看,并無與心肌IRI相關(guān)的專有名詞。但是結(jié)合此種疾病的具體發(fā)病原因和位置,在中醫(yī)當(dāng)中將其納入到了“真心痛”等范疇、中醫(yī)辨證認為此種疾病屬于氣虛血瘀所致,本虛標(biāo)實帶來的疾病。加味丹參飲這一藥物本就是缺血性心臟病治療當(dāng)中的常見藥物。由于疾病的發(fā)病位置在心,所以將原本方劑當(dāng)中的砂仁去除掉,增加了黃芪、紅花、當(dāng)歸和赤芍等。黃芪具有補氣培元的效果。引入丹參能夠起到專入血分功效,到達患者臟腑,起到化瘀功效。當(dāng)歸則可以起到濡養(yǎng)扶正,治本的功效。整個方劑的功效是通絡(luò)止痛、活血益氣等。同時本研究還構(gòu)建起了IRI模型,結(jié)合中西醫(yī)理論來分析加味丹參飲對于患者心肌IRI起到的改善作用和保護機制。

細胞凋亡和心肌IRI的發(fā)生之間也存在著十分密切的相關(guān)性。這是因為接受再灌注之后,雖然心肌當(dāng)中得到了有效的血供,但是也讓形成的氧自由基數(shù)量增加,使鈣離子的含量超標(biāo),加速心肌細胞凋亡的進程[7]。這些年有學(xué)者在其研究中指出,導(dǎo)致心肌細胞基因的表達和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常的原因主要是能量代謝[8]。細胞出現(xiàn)壞死或者是凋亡的關(guān)鍵影響因素則是細胞內(nèi)部的ATP水平。心肌IRI情況時,體內(nèi)的Bcl-2表達水平是不斷降低的狀態(tài),而Bax的表達則在不斷增強。

本研究把30只家兔劃分成了三組,空白組、干預(yù)組和模型組。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的免疫雙標(biāo)陽性細胞高于模型組,凋亡心肌細胞數(shù)量少于模型組。心肌細胞壞死范圍更小,出現(xiàn)炎性細胞浸潤的情況也輕于模型組。以上這一結(jié)果都說明了加味丹參飲+Nrf2激活劑干預(yù)的干預(yù)組家兔,心肌纖維的排列整齊程度得到明顯改善。心肌細胞內(nèi)水腫程度較輕,未看到肌漿網(wǎng)擴張,核膜也基本上保持完整。所以認為干預(yù)組的整體干預(yù)效果更好,針對Nrf2激活以及加味丹參飲的應(yīng)用都能夠讓研究對象的IRI心肌功能與結(jié)構(gòu)情況得到改善,更好地保護研究對象的心肌功能。

綜上所述,針對心肌缺血再灌注損傷采用加味丹參飲進行干預(yù),可以幫助更好地保護研究對象的心肌細胞,有更優(yōu)的改善效果。