非小細(xì)胞肺癌中BLK和p-BLK的表達(dá)及其臨床意義

楊 瑛，楊永鳳，倪銀蕓，李 麗，步 宏,，張 立,

肺癌發(fā)病率和病死率位居我國(guó)惡性腫瘤的首位[1]，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)占肺癌的80%，且惡性程度較高。NSCLC可分為不同的組織學(xué)類型，主要包括腺癌(adenocarcinoma, ADC)(≥40%)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous carcinoma, SCC)(30%)，大細(xì)胞癌(large cell carcinoma, LCC)(10%)較少見(jiàn)[2]。目前肺癌的早期診斷和治療仍是臨床和科研的共同難題，患者確診時(shí)多數(shù)已為中晚期，導(dǎo)致治療方式局限，5年生存率僅為16%。因此，尋找有效的早期NSCLC分子診斷治療靶點(diǎn)是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。BLK屬于Src酪氨酸激酶家族(SFK)成員，其家族基因均具有磷酸酪氨酸識(shí)別的SH2結(jié)構(gòu)域和脯氨酸基序識(shí)別的SH3結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化、遷移存活及腫瘤相關(guān)的多種細(xì)胞表面受體信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起促進(jìn)或抑制作用[3]，在惡性淋巴瘤中BLK激活后發(fā)生磷酸化，磷酸化BLK(p-BLK)異常激活腫瘤相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。目前，BLK在NSCLC中的研究較少，且p-BLK蛋白在NSCLC中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)136例NSCLC中BLK和p-BLK蛋白的表達(dá)水平，分析兩者表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系及與預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2008年1月～2013年12月四川大學(xué)華西醫(yī)院存檔的136例NSCLC標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放、化療。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)確定TNM分期，根據(jù)WHO對(duì)NSCLC分類標(biāo)準(zhǔn)確定腫瘤分化程度和組織學(xué)類型，患者中位隨訪時(shí)間為36個(gè)月(范圍1～60個(gè)月)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定48～72 h，脫水和浸蠟，石蠟包埋，4 μm厚切片，67 ℃烤箱中烤片4 h以上。免疫組化采用EnVision兩步法染色，將切片在二甲苯和梯度乙醇中進(jìn)行組織脫蠟水化，在Tris-EDTA溶液中以微波抗原修復(fù)3次×8 min，室溫3%H2O2中封閉內(nèi)源過(guò)氧化物15 min。抗體和試劑：BLK(10510-I-AP，Proteintech公司)、p-BLK(AF8133，Affinity公司)、DAB顯色液(K5007，Dako公司)。一抗工作液(BLK稀釋比1 ∶100、p-BLK稀釋比1 ∶200)經(jīng)4 ℃孵育過(guò)夜，與二抗山羊抗兔IgG(Dako公司)37 ℃孵育50 min。DAB顯色3 min，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，切片脫水透明，中性樹(shù)膠封固。

1.3 結(jié)果判斷BLK和p-BLK蛋白陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色至棕褐色為陽(yáng)性。由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲法閱片。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡視野(200×)，根據(jù)半定量評(píng)分系統(tǒng)，從腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為(-)陰性，1～2分為(+)低陽(yáng)性，3～6分為()中陽(yáng)性，>6分為()強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)及Spearman χ2檢驗(yàn)進(jìn)行BLK、p-BLK的表達(dá)與臨床病理特征的差異性分析，采用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織和癌旁正常肺組織中BLK和p-BLK的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，肺SCC和ADC組織中BLK和p-BLK表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1～4)。NSCLC組織中BLK中+低表達(dá)率(77.2%)和高表達(dá)率(22.8%)及p-BLK中+低表達(dá)率(86.8%)和高表達(dá)率(13.2%)均明顯高于癌旁正常肺組織中BLK(13.3%)和p-BLK(6.7%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖1 肺鱗狀細(xì)胞癌組織中BLK的表達(dá):A.低陽(yáng)性；B.中陽(yáng)性；C.強(qiáng)陽(yáng)性；EnVision兩步法 圖2 肺腺癌組織中BLK的表達(dá):A.低陽(yáng)性；B.中陽(yáng)性；C.強(qiáng)陽(yáng)性；EnVision兩步法

表1 非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常組織中BLK和p-BLK的表達(dá)[n(%)]

2.2 NSCLC中BLK和p-BLK表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組136例NSCLC患者中BLK表達(dá)缺失6例(4.4%)，p-BLK表達(dá)缺失8例(5.9%)，性別和年齡信息均缺失3例(2.2%)。NSCLC組織中BLK表達(dá)與分化程度呈正相關(guān)(P<0.05，表2)，與患者性別、年齡、病理分型和TNM分期均無(wú)相關(guān)性。p-BLK表達(dá)與NSCLC臨床病理特征均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 非小細(xì)胞肺癌中BLK和p-BLK蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 NSCLC中BLK和p-BLK表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系本組136例NSCLC患者有2例失訪，通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線分析BLK和p-BLK表達(dá)與患者5年生存率的關(guān)系。結(jié)果顯示：BLK高表達(dá)與NSCLC患者的不良預(yù)后無(wú)相關(guān)性(P=0.127)，但p-BLK中+低表達(dá)與肺SCC患者的不良預(yù)后有相關(guān)性(P<0.05)。BLK中+低表達(dá)/高表達(dá)的NSCLC患者分析結(jié)果顯示，低分化亞組中BLK高表達(dá)的患者生存時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BLK高表達(dá)患者在男性(P=0.273)、T2～T4(P=0.119)、N1～N3(P=0.056)、M0(P=0.130)、Ⅰ+Ⅱ期(P=0.115)中生存時(shí)間縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。p-BLK中+低表達(dá)/高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后進(jìn)行分析，p-BLK中+低表達(dá)與男性患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)(P<0.05)，p-BLK中+低表達(dá)患者在低分化(P=0.095)、T2～T4(P=0.183)、N1～N3(P=0.164)、M0(P=0.130)、Ⅰ+Ⅱ期(P=0.297)中生存時(shí)間縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。由于本組病例數(shù)較小，未對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行分析。

圖3 肺鱗狀細(xì)胞癌組織中p-BLK的表達(dá): A.低陽(yáng)性；B.中陽(yáng)性；C.強(qiáng)陽(yáng)性；EnVision兩步法 圖4 肺腺癌組織中p-BLK的表達(dá): A.低陽(yáng)性；B.中陽(yáng)性；C.強(qiáng)陽(yáng)性；EnVision兩步法

圖5 BLK蛋白表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系: A.BLK表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生存期的關(guān)系；B.BLK表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者生存期的關(guān)系；C.BLK表達(dá)與肺腺癌患者生存期的關(guān)系；D.BLK表達(dá)與低分化肺癌患者生存期的關(guān)系

圖6 p-BLK蛋白表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系: A.p-BLK表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生存期的關(guān)系；B.p-BLK表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者生存期的關(guān)系；C.p-BLK表達(dá)與肺腺癌患者生存期的關(guān)系；D.p-BLK表達(dá)與男性肺癌患者生存期的關(guān)系

2.4 Cox回歸模型分析NSCLC患者預(yù)后的影響因素根據(jù)NSCLC患者性別、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期和BLK、p-BLK表達(dá)等變量，構(gòu)建多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。結(jié)果顯示：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者生存時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.496，95%CI=1.405～4.434，P=0.002)；BLK高表達(dá)患者比中+低表達(dá)患者生存時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.874，95%CI=1.035～3.394，P=0.038)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和BLK高表達(dá)可做為影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表3)。

表3 多因素Cox分析非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響因素

3 討論

目前BLK基因的研究主要集中于自身免疫疾病，BLK基因位于8p23～p22區(qū)域，編碼酪氨酸激酶BLK蛋白[4]，參與B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)和B細(xì)胞發(fā)育。研究表明，BLK表達(dá)上調(diào)可影響B(tài)淋巴細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制，使個(gè)體易產(chǎn)生嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)[5-6]。

SFK在腫瘤中的重要性已得到廣泛認(rèn)可，其成員在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中作為癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)了SFK抑制劑的發(fā)展[7-9]。BLK作為SFK的成員之一，其表達(dá)與多種惡性腫瘤的致癌相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma, CTCL)患者的病變皮膚活檢中，有惡性T細(xì)胞的BLK異位表達(dá)，且在體外促進(jìn)CTCL細(xì)胞系的增殖，另BLK在T細(xì)胞白血病淋巴瘤(adult T-cell leukemia lymphoma, ATLL)耐藥機(jī)制中也起重要作用[10-14]。有研究針對(duì)人BLK的致癌能力建立BLK活性依賴腫瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)BLK組成型活性人Ba/F3細(xì)胞移植在小鼠中形成腫瘤[15]。但在某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)BLK具有抑癌功能，與其激酶活性無(wú)關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道BLK通路在小鼠慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)干細(xì)胞中起抑癌作用，但不影響正常造血干細(xì)胞或造血[16]。本組中BLK和p-BLK在NSCLC組織中表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，高于正常肺組織中的陽(yáng)性率，提示兩者在NSCLC中具有重要作用。

惡性腫瘤中BLK的異位表達(dá)和組成型激活是潛在的致癌信號(hào)途徑，其中DNA甲基化異常是基因表達(dá)異常的重要事件，也是最早被研究的重要表觀遺傳修飾之一，通過(guò)鑒定多種癌癥的關(guān)鍵預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，可在分子水平研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究通過(guò)分析1 095個(gè)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺ADC的基因甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)包括BLK在內(nèi)的10個(gè)異常甲基化和失調(diào)的基因與492例肺ADC患者的總生存率相關(guān)，其中BLK、CNTN2和WNT7A在肺ADC中的表達(dá)水平和患者生存率之間呈負(fù)相關(guān)，需進(jìn)一步行預(yù)后分析或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。也有研究發(fā)現(xiàn)在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，增強(qiáng)子區(qū)域的DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以激活基因表達(dá)并直接參與腫瘤細(xì)胞的遷移[17-18]。本組發(fā)現(xiàn)BLK表達(dá)與NSCLC分化程度呈正相關(guān)(P<0.05)，但BLK高表達(dá)組患者在NSCLC低分化組中生存時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，可能是由于BLK在NSCLC中的甲基化異常的影響，或樣本數(shù)量較少有關(guān)。

目前，p-BLK與NSCLC的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本組結(jié)果顯示，p-BLK表達(dá)定位于NSCLC細(xì)胞質(zhì)，與BLK表達(dá)位置一致，p-BLK的中+低表達(dá)與肺SCC患者和男性患者的預(yù)后均呈正相關(guān)(P<0.05)。我國(guó)男性吸煙率(62.8%)遠(yuǎn)高于女性(3.1%)，吸煙是男性肺癌的主要危險(xiǎn)因素。國(guó)內(nèi)外研究顯示：吸煙與肺SCC關(guān)系尤為密切，隨著吸煙劑量的上升而增強(qiáng)，非吸煙者中肺ADC占比呈上升趨勢(shì)[19-20]；提示p-BLK可能在男性肺SCC中具有重要作用，與患者吸煙情況的關(guān)系比較密切。

綜上所述，本組肺癌中BLK和p-BLK蛋白的表達(dá)水平均高于正常肺組織，且BLK蛋白表達(dá)水平與低分化NSCLC患者預(yù)后具有相關(guān)性，p-BLK蛋白水平與男性肺SCC患者預(yù)后具有相關(guān)性，提示BLK和p-BLK在NSCLC發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用。目前，多項(xiàng)研究證實(shí)BLK在惡性腫瘤中具有致癌或抑癌作用，其中主要研究方向?yàn)锽CR信號(hào)異常和DNA甲基化，鑒于BLK在肺癌中的報(bào)道較少，其在肺癌細(xì)胞演進(jìn)過(guò)程中的分子機(jī)制仍有待深入分析。