CKpan免疫組化與彈力纖維雙重染色在結直腸癌靜脈侵犯中的應用價值

杜曉華，胡玉瑩，李 雪,2，羅碧怡，鄭廣娟，楊海峰

2018年中國癌癥統計報告顯示：我國結直腸癌的發病率、病死率在惡性腫瘤中分別位居第3位、第5位，其中新發病例37.6萬，死亡病例19.1萬[1]。腫瘤血管侵犯(vascular invision, VI)是結直腸癌術后病理分期(pTNM)及臨床個體化治療的重要指標，是結直腸癌Ⅰ類預后因子，同時也是評估腫瘤遠處轉移、預后以及療效預測的重要指標[2]。VI分為淋巴管侵犯和靜脈侵犯兩類，在實際臨床病理工作中，通常用HE染色在顯微鏡下觀察是否有VI，但易造成靜脈侵犯的誤、漏診，導致檢出率偏低及各單位之間檢出率差異較大。近年有研究認為，彈力纖維染色能幫助識別靜脈侵犯，提高靜脈侵犯診斷的陽性率。本文采用CKpan免疫組化染色聯合彈力纖維染色(雙重染色)，使兩者相互結合檢測腫瘤細胞與血管的位置，以期更直觀的展現腫瘤靜脈侵犯的證據，提高結直腸癌的靜脈侵犯檢出率。

1 材料與方法

1.1 標本收集2020年4～5月廣東省中醫院結直腸癌組織學標本60例，患者術前均未接受放、化療等輔助治療，術后經組織病理學檢查明確診斷。其中男性30例，女性30例；年齡24～85歲，平均(64.8±14.1)歲；pT2期9例，pT3期25例，pT4a期26例；伴淋巴結轉移者25例。

1.2 方法

1.2.1HE染色檢測 標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水及石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規HE染色，光鏡下觀察。

1.2.2彈力纖維染色檢測 地衣紅乙醇液，將地衣紅溶于70%乙醇，再加入濃鹽酸，放置1～2天后即可。組織經10%中性福爾馬林固定，常規脫水包埋；切片脫蠟至70%乙醇；加入地衣紅乙醇液浸染3 h；70%乙醇液浸洗2次，每次約0.5 min，至染液不脫出為止；95%乙醇、無水乙醇脫水；二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.3雙重染色檢測 腫瘤組織蠟塊，4 μm厚連續切片，行免疫組化EnVision兩步法染色。抗體CKpan購自珠海泉暉公司，應用羅氏全自動免疫組化儀進行自動加樣，鏡下觀察染色結果可靠，再進行彈力纖維特殊染色(具體步驟參考上述彈力纖維染色)。以肺動脈血管為外對照，結直腸癌組織周邊血管中的彈力纖維組織以及臟層腹膜的彈力纖維組織為內對照。

1.3 結果判讀60例結直腸癌組織均行HE染色、單一彈力纖維染色及雙重染色(CKpan免疫組化聯合彈力纖維雙重染色)。各組病例均由廣東省中醫院2名資深的病理醫師進行判讀及測評，觀察到腫瘤靜脈侵犯為陽性，未觀察到或不確定腫瘤靜脈侵犯為陰性，記錄3種方法的陽性例數和陰性例數。

2 結果

2.1 HE染色在常規HE染色切片，部分病例顯微鏡下見灶性分布的癌細胞，周邊可見厚壁動脈血管，而與之伴行的靜脈血管無法辨識，HE染色切片無法明確是否有腫瘤靜脈侵犯(圖1)。部分病例顯微鏡下見可疑血管壁內的片狀壞死組織，其內可疑低分化的腫瘤細胞，HE染色切片無法明確有無靜脈侵犯(圖2)。

圖1 難以辨認靜脈形態，無法確定有無腫瘤靜脈侵犯，HE染色 圖2 可疑血管壁內可見片狀壞死及出血，其內見可疑低分化的腫瘤細胞，無法明確血管和腫瘤細胞，HE染色 圖3 可清晰勾勒出血管的彈力層呈磚紅色波浪狀，彈力纖維染色 圖4 可見棕褐色的腫瘤細胞團，CKpan呈陽性，EnVision兩步法 圖5 可清晰顯示腫瘤與血管的關系，證實腫瘤侵犯血管，CKpan免疫組化聯合彈力纖維雙重染色 圖6 同時顯示低分化腫瘤細胞和被破壞的血管壁，證實腫瘤侵犯血管，CKpan免疫組化聯合彈力纖維雙重染色

2.2 彈力纖維染色在彈力纖維染色切片，動靜脈壁的彈力纖維呈磚紅色波浪狀著色(圖3)，可顯示動脈及伴隨的靜脈，靜脈管壁內及其彈力纖維層內可見腫瘤細胞，證實為靜脈侵犯。

2.3 免疫組化染色CKpan在結直腸癌細胞的胞質中呈棕褐色(圖4)，未見明確的靜脈管壁，不能證實是否有靜脈侵犯。

2.4 雙重染色雙重染色切片中CKpan免疫組化呈棕褐色胞質著色，能夠清晰地顯示腫瘤細胞，彈力纖維染色呈磚紅色顯示波浪狀的血管壁，其不但能顯示血管壁彈力纖維的缺失和排列紊亂，還能觀察到多數厚壁血管彈力纖維增生和血管壁重構，以及CKpan陽性的腫瘤細胞早期浸潤血管壁的現象(圖5)。對可疑血管壁內少量懷疑的細胞團，雙重染色切片不僅勾勒出血管壁輪廓，其內的低分化腫瘤細胞亦能清晰顯示，可證實有靜脈侵犯(圖6)。

2.5 VI檢出率對比經統計結果顯示，HE染色VI檢出率為26.7%，單一彈力纖維染色VI陽性率為41.7%，而雙重染色VI陽性率為63.3%，三組比較差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

表1 HE、彈力纖維染色及雙重染色切片各靜脈侵犯的檢出率[n(%)]

3 討論

根據結直腸癌AJCC指南，腫瘤VI是獨立于Dukes分期及pTNM分期而影響患者預后的重要檢測指標[3]，VI是Ⅱ期結直腸癌患者接受輔助化療的高危因素之一，也是其復發和預后的獨立影響因素[4]。脈管侵犯的類型可進一步細分為淋巴管侵犯和靜脈侵犯[3]，靜脈侵犯又被稱為“大血管”侵犯(“large vessel” invasion)，已有研究表明其是結直腸癌血道轉移和生存的獨立預后因素。因此，準確識別結直腸癌手術標本中的靜脈侵犯對臨床后續治療決策和預后評估具有重要價值[5]。然而，已有研究結果表明，不同研究中心的靜脈侵犯報告率存在較大差異，并認為是否使用特殊染色輔助判斷也是導致差異的原因之一[5]。彈力纖維廣泛存在于血管壁，尤其是大血管的管壁，因此可以通過彈力纖維染色判斷腫瘤是否侵犯血管。國外Kirsch等[5]對40例結直腸癌的HE染色切片進行彈力纖維染色，發現彈力纖維染色切片對腫瘤靜脈侵犯的準確率比常規HE染色高2倍(46.4%vs19.6%，P=0.001)。Howlett等[6]對92例結直腸癌術后HE染色切片未發現腫瘤血管受侵的標本開展彈力纖維染色，其結果顯示其中41例(44.0%)切片可觀察到腫瘤靜脈侵犯，彈力纖維染色的識別率明顯提高，且只需1張彈力纖維染色切片即可評估。國內于雪姣等[7]研究結果顯示，常規HE染色的靜脈侵犯檢出率為32.0%，而彈力纖維染色為66.7%，后者的敏感性為65.8%，而特異性高達100.0%。以上研究提示彈力纖維染色在結直腸癌靜脈侵犯中的良好效果及實踐意義。雷光等[8]報道在彈力纖維染色切片上對腫瘤細胞的顯示低于常規HE染色的清晰度，在僅有少量腫瘤細胞侵犯彈力纖維膜或分化差的癌，以及伴腫瘤壞死及組織細胞集聚等情況，彈力纖維染色判讀受到影響。同時，彈力纖維染色的識別率數據報道不一致。可能存在以下原因：(1)標本取材蠟塊較少，有些病例血管彈力纖維層完全破壞，無法顯示著色；(2)技術人員操作的原因，未能嚴格按特殊染色操作要求，導致彈力纖維染色效果欠佳；(3)各醫院使用的彈力纖維染色的配制試劑和顏色顯示方法不統一，敏感性有差異[8]，且炎癥和腫瘤均可導致彈力纖維的不連續表現，使判斷腫瘤侵犯血管彈力層的難度增加。

目前，彈力纖維染色與免疫組化雙重染色在心血管系統及肺癌的胸膜浸潤情況，以及許多腫瘤血管內癌栓的診斷中已有較多報道[9-10]，但關于結直腸癌血管壁的腫瘤細胞浸潤情況報道較少。本實驗雙重染色切片的靜脈侵犯陽性率為63.3%，與單一彈力纖維染色的41.7%相比，差異有顯著性。因此，我們認為雙重染色切片對結直腸癌靜脈侵犯的檢出有獨特的優勢，同時可彌補上述原因的不足，主要優勢表現在以下幾點：(1)染色對比清楚，定位準確，易于判讀。為了準確識別腫瘤靜脈侵犯，必須掌握腫瘤組織學結構、腫瘤細胞排列形式、腫瘤細胞形態及腫瘤細胞與間質的關系，周邊動脈及靜脈的結構及走向，尤其是分化差的癌及血管壁破壞的病例，在HE形態學上鑒別困難，而雙重染色切片中腫瘤細胞質呈棕褐色，血管的彈力纖維呈磚紅色，對比明顯。部分病例可見腫瘤細胞對鄰近的彈力纖維進行“蠶食”，同時能觀察到少量腫瘤細胞浸潤至血管的彈力纖維層內，這種微小的改變難以用單一彈力纖維染色發現。雙重染色切片可直接觀察與腫瘤細胞相鄰的血管彈力纖維變化，且能突顯腫瘤對彈力纖維的促增生及侵襲能力。(2)減少操作步驟，節約閱片時間。獨立染色方案需經常切換HE及彈力纖維染色的切片進行定位，特別是少量腫瘤細胞在彈力纖維明顯增生的背景下，可能發生遺漏的風險。(3)排除干擾，提高準確性。對于腫瘤組織壞死后發生退變、少量脫落的腫瘤細胞或低分化癌等情況，在HE染色與獨立彈力纖維染色中難以與組織細胞鑒別，雙重染色在此類病變應用中優勢更加明顯，也有效避免血管內皮細胞或纖維母細胞增生等假陽性情況。(4)減少技術人員工作量，一張雙重染色切片即可明確腫瘤細胞與血管彈力纖維層的關系，減少了切片數量，也相應減少了組織損耗和蠟塊數量，節約腫瘤組織儲存空間。

雙重染色優勢突出，但在應用上依然存在其局限性，主要表現為CKpan陰性病例。不適用本方法的病例包括：極少見的未分化癌、肉瘤、神經內分泌癌等。這部分病例診斷可加做免疫組化低分子量CK8/18或神經內分泌染色與彈力纖維雙重染色法。對位于黏膜內或黏膜下層的腫瘤，該區域主要是小血管或淋巴管，缺乏大血管的彈力纖維層，可使用血管標記如CD34、CD31或淋巴管標記如D2-40染色等，進行脈管侵犯的判讀。

綜上所述，本實驗結果顯示雙重染色切片能清楚顯示腫瘤細胞與血管纖維層的關系，其結合了單一免疫組化和彈力纖維染色的優點，可同步顯示血管及腫瘤細胞，能更好的觀察腫瘤細胞與血管的毗鄰關系，可以顯著提高靜脈侵犯的檢出率。VI陽性腫瘤患者提示預后不良，雙重染色切片可為結直腸癌分期及預后提供更準確及更有價值的參考，對明確病理診斷及制定臨床治療方案具有積極意義。