甲醛固定石蠟包埋切片經特殊染色后熒光定量聚合酶鏈反應檢測的再利用

魏 雪，葉勝兵，章如松，夏秋媛，饒 秋，馬恒輝，吳 楠

結核病是由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的特異性炎癥，在甲醛固定石蠟包埋組織切片中查見MTB是確診結核的“金標準”。目前，結核病診斷的主要輔助檢測方法是特殊染色和qRT-PCR檢測。在臨床病理診斷中，部分結核病患者由于獲取標本困難，穿刺標本微小，病理組織多被用于HE染色、特殊染色，所剩組織太少無法進行相關分子檢測。在全載玻片成像掃描技術應用下，將病理切片實現全數字化，形成數字切片，保存現有病理圖像的同時，再利用特殊染色過切片進行qRT-PCR檢測的可行性分析在國內鮮有報道。本實驗通過對結核病患者組織切片經特殊染色后應用qRT-PCR檢測，比較特殊染色處理前、后qRT-PCR檢測結果的符合率，以期探討標本回收利用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2020年1月東部戰區總醫院臨床送檢診斷為結核標本30例，其中穿刺活檢標本10例，手術切除標本20例；肺組織23例，肺外組織7例，病變部位主要為肺、肝、腎臟等；男性23例，女性7例；年齡20～58歲，平均(39.0±19.0)歲。所有組織標本納入標準為腫瘤細胞含量≥20%[1]，均行特殊染色及qRT-PCR檢測。

1.2 組織處理及方法標本均采用10%中性福爾馬林進行固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片7張，分別用于HE染色、特殊染色和qRT-PCR檢測。大組織標本每張切片至少切取2張蠟片，小組織標本每張切片上至少切取3張蠟片。抽取其中3張切片作為實驗組先進行特殊染色再行qRT-PCR檢測，剩余3張切片納入對照組單獨進行qRT-PCR檢測。

1.3 特殊染色采用PAS染色、PASM染色和抗酸染色，具體實驗方法參考《臨床技術操作規范·病理學分冊》中的染色方法進行[2]。

1.4 qRT-PCR檢測實驗組切片浸入二甲苯中直至蓋玻片自然脫落，無水乙醇漂洗，風干后刮片收集組織；對照組切片直接浸入二甲苯脫蠟，無水乙醇漂洗，風干后刮片收集組織。操作嚴格按Qlamp DNA FFPE Tissue Kit操作說明書進行，收集樣本DNA，后續步驟按MTB檢測試劑盒說明書進行。

1.5 結果判定(1)PAS染色真菌呈紫色，細胞核呈藍色。PASM染色真菌呈黑色，細胞核呈藍色。抗酸染色MTB呈亮紅色，表現為細桿狀/短樣狀、菌體清晰、不折光，或者為稍彎的念珠樣細桿狀物，常可見黑色的著絲點，位于MTB的一端或其他部位，與組織切片位于同一水平面上[3]。非MTB及其他成分呈淡藍色或亮紅色，有折光性，背景染色呈淡藍色。(2)qRT-PCR檢測按MTB核酸檢測試劑盒產品說明書進行，檢測樣本Ct值≥27和無數值時，判斷為陰性；檢測樣本Ct值<27時，判斷為陽性。

1.6 統計學分析應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用Kappa一致性檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

30例結核標本組織學形態表現為上皮樣肉芽腫性病變(圖1)。抗酸染色MTB呈亮紅色細桿狀、菌體清晰、不折光，背景染色呈淡藍色(圖2)。qRT-PCR檢測實驗組MTB陽性11例(36.7%)，陰性19例(63.3%)。對照組MTB陽性11例，另外19例同樣檢測陰性。實驗組和對照組檢測結果符合率一致，Kappa系數為1.000(P<0.001，表1，圖3)。

圖1 肉芽腫性炎伴壞死 圖2 MTB呈亮紅色細絲狀，抗酸染色

圖3 A.實驗組擴增曲線Ct值小于27.0，檢測結果為陽性；B.對照組擴增曲線Ct值小于27.0，檢測結果為陽性；紅色為陽性對照，綠色為陰性對照，藍色為檢測標本

表1 qRT-PCR檢測MTB

3 討論

常用的結核病原學主要檢測項目為特殊染色和qRT-PCR檢測。PAS、PASM染色陽性結果顯示莢膜結構，提示是否存在新型隱球菌、球孢子菌、曲菌病及皮膚真菌感染等。抗酸染色法檢測MTB，可有效結合組織形態學進行定位觀察，具有操作簡單、直觀準確、特異性高的優點，但其靈敏度略低。抗酸染色陽性結果既可能是MTB，也可能是非MTB或者麻風桿菌等，故需要應用其它檢測手段。qRT-PCR檢測直接測定MTB的DNA，WHO推薦其為結核診斷的最佳檢測方法，選擇相對保守的病原體核酸片段進行PCR擴增與熒光信號收集，具有靈敏度高、特異性強、重復性好的優點，檢出率高于抗酸染色，具有較高的診斷價值[4-5]。無論是哪一類檢測方法，均不可避免出現假陰性，由于存在石蠟雜質，抑制試劑反應，故在檢測過程中應嚴格按照試劑盒說明書要求，盡量減少誤差，避免交叉污染。總之，在常規工作中客觀看待兩種檢測方法各自的局限性，讓兩者恰如其分地輔助結核病的診斷，并結合患者的病史、臨床癥狀及影像學資料，有效地提高結核病病理診斷的準確性。

MTB可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機體，引起多組織器官的結核病，其中以肺部最為常見。本組中肺結核占大部分，尤其是肺穿刺組織標本，其穿刺標本較微小，前期的常規檢測使蠟塊上的組織已所剩無幾，難以再行切片；或者部分會診患者帶來的白片數量有限，而無法在短時間內重新獲得切片，都使得qRT-PCR檢測無法進行，無法明確患者的病理診斷結果，延誤診治。本組著重探討標本回收利用的新方法，有效利用僅存的切片進行后續輔助檢查。將病理切片圖像信息通過全玻片成像掃描技術形成數字切片，保存現有病理圖像的同時，再利用特殊染色過的切片進行分子檢測，滿足病理診斷需求。

特殊染色是將組織細胞中的待檢測物質直接與染料結合而被染上顏色，從而顯示與確定組織或細胞中的正常結構或病理過程中出現的異常物質、病變及病原體等。qRT-PCR檢測是針對MTB特異性設計相應的引物和探針，應用PCR法體外擴增，通過熒光信號的變化測定DNA，從而特異性診斷MTB。特殊染色及qRT-PCR檢測無論是從檢測對象、檢測步驟、所用試劑等均不相同，不會互相干預影響組織切片的檢測結果，理論上經過特殊染色過的切片再進行qRT-PCR檢測是可行的。此次實驗也證實了這一理論，特殊染色前、后qRT-PCR檢測結果具有高度的一致性，利用特殊染色后的切片可以滿足分子病理檢測的需求。

隨著腫瘤研究角度和研究方法的不斷更新，腫瘤靶點的個體化分子檢測越來越受到臨床重視，組織標本的珍貴性顯而易見。實驗已經證明，組織切片經特殊染色后能夠進行qRT-PCR檢測，不僅節省了標本的使用量，更減少了患者二次取材的可能性，為臨床實驗項目更全面的開展提供一定幫助，是值得推廣的技術新方法。