泡騰輔助液相微萃取/高效液相色譜法檢測蜂蜜中7種喹諾酮類藥物

王藝霞，楊琳燕，黃 迪，李留安，李 娜，張 偉，

郭永澤2*，李 存1*

（1.天津農學院 動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381）

作為一類重要的合成抗菌藥物［1］，喹諾酮類藥物（QNs）由于廣譜抗菌活性被廣泛應用于各種疾病和感染的治療［2］。然而，不當使用或濫用QNs會在蜂蜜中造成獸藥殘留，對消費者產生直接的毒性影響，如過敏反應、毒性反應和抗藥性。因此，開發高選擇性和高靈敏度的動物源性食品中獸藥殘留的測定方法勢在必行［3－4］。目前的儀器方法如高效液相色譜法（HPLC）［5］、毛細管電泳法［6－7］和氣相色譜法［8］均能較好滿足獸藥殘留的測定需求，樣品前處理技術從而成為制約動物源性食品中殘留檢測發展的關鍵［9］。

液相微萃取技術（LPME）集樣品采集、萃取、富集等過程于一體，具有操作簡便、富集倍數高、成本低等優點，被廣泛應用于多個領域的分析檢測［4，10－11］。與液－液萃取和固相萃取技術相比，LPME操作簡單，降低了有毒有機溶劑的用量［12］。其強大的預濃縮能力和較短的提取時間，不僅為儀器檢測提供了高效、準確的基礎，也為基質復雜樣品的分析提供了一個非常有效的處理方案［13］。

為了克服傳統有機溶劑作為萃取劑的不足，新型綠色的可切換溶劑（SS）逐漸被應用于LPME［14］，以減少對實驗人員及環境的危害。SS是可轉換親水親油特性的一種特殊液體，在通入或去除CO2的情況下能夠可逆地從一種形式切換到另一種形式［15］。它主要包括可切換親水性溶劑（SHS）和可切換極性溶劑（SPS）。SHS通常由中鏈脂肪酸和叔胺組成，價格更低，更穩定，且與水的混溶性是完全可逆的，因此SHS較SPS更合適作為提取溶劑。基于SHS的液相微萃取方法具有綠色、快速、簡單、廉價、方便等優點［16］。

本文提出了一種注射器內完成的基于可切換親水性溶劑的泡騰輔助液相微萃取技術（EA－LPMESHS），并以可切換親水性溶劑壬酸作為萃取劑進行提取及富集。整個萃取過程均在注射器內完成，操作簡便、省時，克服了傳統LPME中因萃取相過少而分離困難的缺點。并結合高效液相色譜－熒光檢測法（HPLC－FLD）實現了蜂蜜中麻保沙星、諾氟沙星等7種喹諾酮類藥物的同時測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

麻保沙星（MAR，99.0%）、諾氟沙星（NOR，99.0%）、環丙沙星（CIP，92.3%）、洛美沙星（LOM，98.7%）、恩諾沙星（ENR，99.9%）、二氟沙星（DIF，98.0%）、氟甲喹（FLU，99.4%）購于德國Dr.Ehrenstorfer；戊酸、己酸、辛酸、壬酸（純度大于98%，上海麥克林公司）；Na2CO3、H2SO4、NaHCO3、HCl（分析純，天津風船化學試劑公司）；庚酸（98%，上海梯希愛化成工業發展有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）。

Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測器（美國Water公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱為Inertsustain C18（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動相：A為0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為1.0 mL/min；進樣量為10μL；柱溫為（30±5）℃。梯度洗脫條件如下：0～10 min，12%～30%B；10～18 min，30%～60%B；18～19 min，60%～90%B；19～22 min，90%B；22～23 min，90%～12%B；23～30 min，12%B。熒光檢測器波長設置如下：0～6.6 min，激發波長為297 nm，發射波長為515 nm；6.6～10.5 min，激發波長為280 nm，發射波長為450 nm；10.5～20 min，激發波長為320 nm，發射波長為365 nm。

1.3 標準溶液的配制

分別稱取MAR、NOR、CIP、LOM、ENR、DIF、FLU標準品各10 mg，溶于2.0 mL 0.03%NaOH，充分溶解后用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成100.0 mg/L的標準儲備液。使用時以甲醇稀釋至所需質量濃度，所有溶液儲存于4℃黑暗條件下。

1.4 樣品前處理

從天津市當地購買6種不同品牌的蜂蜜樣品，用于實際樣品檢測。

稱取2.0 g蜂蜜于50 mL離心管中，添加500 ng/g的QNs，渦旋混勻后加入18 mL 60℃去離子水，渦旋至均一溶液。將所得蜂蜜水溶液（20 mL）于4℃保存，待萃取。

1.5 液相微萃取過程

用移液槍吸取2.0 mL加標蜂蜜水溶液于5.0 mL注射器內，依次加入200μL壬酸和400μL 2.0 mol/L Na2CO3，混合均勻，溶液呈渾濁狀態并伴有氣泡，繼續加入300μL 2.0 mol/L H2SO4，渦旋混勻1.5 min，溶液產生大量氣泡。將注射器倒置幾分鐘，溶液出現分層，上層為萃取相，下層為水相，推動注射器將水相排出，保留萃取相，并用冰醋酸定容至2.0 mL，待HPLC－FLD分析。微萃取過程見圖1。

圖1 EA－LPME－SHS方法操作過程Fig.1 Procedure of EA－LPME－SHS approach

2 結果與討論

采用“一次一個變量”的原則，改變相應的實驗條件，對含有500 ng/g QNs的空白蜂蜜樣品進行分析，以確定最佳提取條件（n=3）。

2.1 萃取劑種類的選擇

理想的SHS應滿足以下條件：能夠通過調節溶液pH值在水混溶狀態和水不混溶狀態之間可逆切換；對疏水形式分析物的溶解性較強；毒性低，沸點高。考察了滿足上述要求的5種中鏈飽和脂肪酸（戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸）作為萃取劑時對目標分析物萃取效率的影響。提取過程中，5種脂肪酸均具有可切換能力，在pH值高于pKa的條件下能解離成親水形式。結果顯示，壬酸的提取效果優于其他4種脂肪酸，尤其是NOR和CIP的提取回收率明顯高于其他組（見圖2A），這可歸因于其較低的粘度和較高的目標分析物溶解度。因此，選擇壬酸作為萃取劑。

圖2 萃取溶劑種類（A）、萃取溶劑體積（B）、pH調節劑類型（C）、Na2CO3體積（D）、H2SO4體積（E）及提取時間（F）的影響Fig.2 Effects of extraction solvent type（A），extraction solvent volume（B），pH regulator type（C），Na2CO3 volume（D），H2SO4 volume（E）and extraction time（F）

2.2 萃取劑體積的優化

萃取劑體積是影響提取回收率的重要參數。向2.0 mL蜂蜜溶液中添加100、150、200、250、300μL的壬酸，考察了萃取劑體積對目標分析物萃取效率的影響。結果表明，當壬酸體積由100μL增至200μL時，7種目標分析物的提取回收率顯著提高；而壬酸體積繼續增至300μL時，目標分析物的提取回收率呈下降趨勢（圖2B）。這可能是由于萃取劑過多帶來的稀釋效應導致回收率降低。最終確定萃取劑體積為200μL。

2.3 pH調節劑類型的選擇

根據Shih等［17］報道，當pH值高于其pKa至少3個pH單位時，大約99.9%的脂肪酸會被解離成陰離子形式，并作為一種陰離子表面活性劑存在；相反，當pH值低于其pKa至少3個pH單位時，99.9%以上的脂肪酸呈中性疏水形式。壬酸的pKa為4.96，可通過添加強堿和強酸改變其疏水和親水性能。此外，二氧化碳的鼓泡有利于增大混合物的接觸面積，從而提高回收率。因此，分別選擇Na2CO3和NaHCO3作為堿性調節劑，HCl和H2SO4作為酸性調節劑，測定NaHCO3－HCl、NaHCO3－H2SO4、Na2CO3－HCl和Na2CO3－H2SO44種pH調節劑對萃取效率的影響。由圖2C可見，Na2CO3－H2SO4和Na2CO3－HCl的提取效果優于NaHCO3－HCl和NaHCO3－H2SO4，這可能是因為Na2CO3的堿性強于NaHCO3，相同用量下，以Na2CO3為堿性調節劑時壬酸的轉化率高，對分析物的提取效率更強。而且NaHCO3的鼓泡能力弱于Na2CO3，這也會導致萃取效率降低。與Na2CO3－HCl相比，以Na2CO3－H2SO4為pH調節劑的提取回收率更高。因此，選擇Na2CO3和H2SO4分別作為堿性和酸性調節劑。

2.4 pH調節劑體積的優化

在Na2CO3存在下，壬酸可轉變為水溶性形式，即轉化為陰離子表面活性劑壬酸鈉。Na2CO3溶液的加入量越大，壬酸的轉化率越高。因此，考察了不同體積（200、250、300、400、450μL）2.0 mol/L Na2CO3溶液對目標分析物萃取效率的影響。結果表明，當2.0 mol/L Na2CO3溶液的添加體積增至400μL時，提取回收率才有明顯提高，而添加體積增至450μL時，萃取效率降低（見圖2D）。一方面可能是因為Na2CO3添加較少，而H2SO4用量不變，溶液pH值過低，使得弱酸性的QNs解離成離子形式而難于富集，導致回收率降低；另一方面，隨著Na2CO3的增加，H2SO4的量不足以使全部壬酸轉變為疏水狀態，而導致萃取效率降低。因此，選擇2.0 mol/L Na2CO3的最佳用量為400μL。

H2SO4的加入可使壬酸轉變為原來的疏水性形式，從而實現相分離。考察了不同體積（250、300、350、400、500μL）2.0 mol/L H2SO4溶液對目標分析物萃取效率的影響。結果顯示，當2.0 mol/L H2SO4溶液的添加體積從250μL增至300μL時，所有QNs（除NOR外）的萃取回收率明顯提高；當添加體積超過300μL時，萃取效率明顯下降（圖2E）。其原因可能是隨著H2SO4體積的增加，溶液pH值逐漸降低，水相中發生解離的QNs無法富集，導致回收率低。因此，選擇2.0 mol/LH2SO4的最佳用量為300μL。

2.5 提取時間的優化

渦旋可增強分析物在水相與有機相中的傳質作用，加強CO2的鼓泡能力，從而提高萃取效率。考察了不同渦旋時間（0.5、1.0、1.5、2.0 min）對7種QNs萃取回收率的影響。結果顯示，當渦旋時間增至1.5 min時，所有QNs的回收率均達到最高；而渦旋時間增至2.0 min時，所有QNs的回收率降低（圖2F）。理論上，渦旋時間越長，萃取效率越高，而實驗結果顯示，隨著渦旋時間的增加，一些藥物的結構可能被破壞，導致萃取效率降低。因此，選擇最佳提取時間為1.5 min。

2.6 方法驗證

配制質量濃度分別為2.0、5.0、10、50、100、200μg/L的混合標準工作溶液，采用本方法進行測定，并以7種QNs的峰面積（y）對其質量濃度（x，μg/L）進行線性擬合。結果表明，5種QNs在2.0～200μg/L質量濃度范圍內（NOR和CIP為2.0～100μg/L）呈良好線性關系，相關系數（r2）為0.999 5～0.999 9，方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）分別為3.0 ng/g和10 ng/g（見表1）。

表1 優化條件下7種QNs的線性關系、檢出限及定量下限Table 1 Linear relations，LODs and LOQs of seven QNs under the optimal conditions

采用本方法對空白蜂蜜樣品進行3個濃度水平（10、100、500 ng/g）的加標回收實驗，重復進樣3次，連續測定6 d。結果表明，7種QNs的回收率為62.8%～117%，日內、日間相對標準偏差（RSD）均不大于6.2%（見表2）。上述結果表明，該方法的LOD和LOQ較低，具有良好的準確性、重復性和線性。

表2 7種QNs的回收率與相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of seven QNs

2.7 實際樣品檢測

為評價方法的適用性，在最佳條件下對6種不同品牌的蜂蜜樣品進行檢測（n=3），所有蜂蜜樣品均未檢出上述7種QNs。選擇3種蜂蜜樣品進行100 ng/g QNs的加標實驗，得到7種QNs的回收率為78.8%～120%，RSD小于5.1%。圖3分別顯示了在優化條件下添加100 ng/g QNs的蜂蜜樣品、10 ng/mL QNs標準溶液以及空白蜂蜜樣品的色譜圖。結果表明，該方法適用性較好，可用于蜂蜜樣品中QNs的檢測。

圖3 蜂蜜樣品添加100 ng/g QNs（a）、10 ng/mL QNs標準溶液（b）與空白蜂蜜樣品（c）的色譜圖Fig.3 Chromatograms of real honey sample spiked with 100 ng/g QNs（a），10 ng/mL QNs standard solution（b）and blank honey sample（c）

2.8 與其他方法的比較

將EA－LPME－SHS方法與檢測QNs的其他文獻方法進行了比較（表3）。與其他方法相比，本方法具有萃取劑用量少和提取時間短的優點［5，18－19］。此外，采用可切換親水性溶劑壬酸為萃取劑，對環境和實驗人員友好。該方法是一種綠色、快速、靈敏、簡便、省時的前處理方法，可用于蜂蜜樣品中QNs的檢測。

表3 與其他萃取方法的比較Table 3 Comparison with the previous extraction methods

3 結 論

本文建立了一種基于注射器內的可切換親水性溶劑－泡騰輔助液相微萃取技術聯合高效液相色譜－熒光檢測分析蜂蜜中7種喹諾酮類藥物的方法。通過調節pH值改變壬酸的親水性與疏水性，從而對分析物進行提取，整個提取過程均在注射器中完成，無需離心，克服了萃取相少、分離困難的缺點。該方法具有回收率高、靈敏度好、成本低、重復性好、操作方便、提取時間較短和環境友好等優點。