SERS結合光譜法研究正壬酸香草酰胺與人血清白蛋白的相互作用

周家羽，周光明，陳 蓉，羅 丹

（西南大學 化學化工學院，發光與實時分析教育部重點實驗室，重慶 400715）

藥物及其他生物活性化合物對人體血液循環系統蛋白質成分的影響是當前的研究熱點。眾所周知，藥物與血液成分的相互作用不僅會影響藥物的生物利用度，還會影響生物分子的功能，對藥理活性產生重大影響［1－3］。大多數藥物的生物活性和藥理活性可以通過藥物與蛋白質之間的相互作用進行研究。較高的血漿循環水平和白蛋白具有結合多種化合物的能力，但通常認為藥物與白蛋白的相互作用是主要的作用方式［4］，而光譜技術作為藥物-白蛋白相互作用研究的主要手段引起了人們的極大興趣［5－7］。

辣椒素是具有鎮痛止癢、抗炎消腫與抗腫瘤等作用的辣椒果實次生代謝產物［8］。正壬酸香草酰胺（Nonivamide，OC）與辣椒素有相似的化學結構和藥理作用，可在神經生理、藥理學研究中用作其替代物，現已廣泛應用于醫藥、農業等行業［9］。目前關于OC的大部分研究主要集中于合成或間接評估OC的應用方面，有關OC與血清白蛋白之間相互作用的研究較少。人血清白蛋白（HSA）是人血漿中最豐富的血漿蛋白（約45 mg/mL），具有配體結合特性、抗氧化功能和酶活性［10－11］，負責將各種氨基酸、藥物分子、脂肪酸及其代謝物結合并轉運至其分子靶位［12］。盡管HSA結構復雜，但其分子中僅含有一個色氨酸殘基（Trp214），這一特點使其成為模型蛋白，為研究蛋白質與藥物相互作用時的構象變化和局部微環境變化提供了便利［13－15］。藥物與血清白蛋白的強結合導致血漿中游離藥物的利用率低，而弱結合則導致藥物分布較少［16］，因此藥物對血漿白蛋白的親和力將直接決定可在游離狀態下用于治療的藥物量［3］。

熒光光譜法是研究藥物和HSA相互作用的方法之一，可得到結合常數及藥物引起的HSA的結構變化等信息［17－18］。表面增強拉曼散射（SERS）技術是一種用于單分子檢測和界面分析等的分子振動光譜，對研究分子間的相互作用非常靈敏，可提供分子構型和化學鍵變化方面的信息［19－20］，也可以解釋藥物與血漿或血清白蛋白之間相互作用的機制。在非常低的藥物濃度下，SERS的排他性和靈敏的檢測能力使其成為血漿或血清白蛋白藥物敏感領域中一種有吸引力的工具［21－22］。

本文利用多種光譜技術討論了OC與HSA相互作用的性質，包括相互作用結合力和子域微環境的變化，同時對結合過程的熱力學參數進行了評估。OC－HSA相互作用的有關信息不僅有利于藥物設計和疾病治療，也可為藥物與生物大分子相互作用機制的研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UItra－55場發射掃描電子顯微鏡（SEM，德國Carl zeiss NTS GmbH）；UV－2450紫外可見光譜儀（日本島津）；雷尼紹拉曼光譜儀（英國雷尼紹），選用633 nm激光器；F－7000熒光光度計（日本日立）。

HSA用Tris－HCl緩沖液（pH 7.4，0.05 mol/L）配制成1.0×10-4mol/L的儲備液，OC用50%無水乙醇/Tris－HCl溶液配制成1.0×10-3mol/L的儲備液；氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉（Na3－Cit）及以上試劑均為分析純，購于上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 紫外可見吸收光譜

將HSA溶液濃度固定為1.0×10-5mol/L，控制HSA與OC的濃度比，將其混合液恒溫水浴30 min，掃描波長范圍為200～800 nm的紫外可見吸收光譜。

1.3 熒光光譜

取500μL HSA溶液和不同濃度的OC溶液加至10 mL比色管中，用Tris－HCl緩沖溶液定容，然后置于298 K（303 K或310 K）恒溫水浴30 min。熒光光譜參數設定：激發和發射狹縫寬度均為5 nm，激發波長280 nm，記錄發射波長范圍230～500 nm的光譜；同步熒光光譜參數設定：固定Δλ（Δλ=λemλex）為15 nm和60 nm，掃描熒光光譜。

1.4 金納米顆粒（AuNPs）的制備

參考并改進了P.C.Lee法［23］制備AuNPs。首先配制100 mL HAuCl4（1.5 mol/L）和50 mL檸檬酸鈉（1%）溶液；然后取50 mL HAuCl4溶液于燒瓶，采用油浴加熱沸騰后迅速加入5 mL檸檬酸鈉溶液，待溶液變為酒紅色后繼續加熱15 min；最后持續攪拌冷卻至室溫，置4℃冷藏備用。

1.5 表面增強拉曼光譜

將OC固體置于干燥的玻片上進行普通拉曼光譜（NRS）測試。將HSA與OC的混合液與等體積AuNPs混合進行SERS測定。選用633 nm的激光器，掃描范圍為350～2 000 nm，曝光時間為10 s，累計測定3次。

2 結果與討論

2.1 金納米顆粒的表征

AuNPs的SEM圖如圖1A所示，AuNPs呈尺寸約50 nm的小球狀，大小及分布均勻。圖1B為AuNPs的紫外光譜圖，其在520 nm處出現最大吸收峰，與文獻報道一致［24］；加入OC后，吸收峰紅移至603 nm，說明OC的附著使AuNPs的偶極矩增大，同時最大吸收峰的峰強降低；再加入HSA溶液，體系的最大吸收峰發生藍移，最大吸附峰強度進一步降低。說明與HSA的相互作用使OC整個電子共軛體系的能量發生改變，并引起光譜變化。

圖1 金納米溶膠的SEM圖（A）及室溫下金納米溶膠的紫外光譜圖（B）Fig.1 SEM image（A）and UV－Vis spectra（B）of AuNPs

2.2 OC與HSA作用的紫外可見吸收光譜

HSA色氨酸和酪氨酸殘基中的芳雜環發生n－π*和π－π*電子躍遷，使得HSA在280 nm處有吸收峰［25］。如圖2所示，HSA的吸收峰強度隨OC濃度的增加逐漸增強，表現為增色效應。由于已消除了藥物的吸收作用，因此吸收強度的提高可能歸因于藥物與蛋白質之間形成的基態復合物［26］。結果表明，OC和HSA的相互作用會影響蛋白質的微環境和基態復合物（OCHSA）的形成，使蛋白質肽鏈伸展，內部氨基酸殘基的微環境極性及疏水性產生變化，從而導致蛋白質構象結構的進一步改變。

圖2 室溫下OC－HSA的紫外可見吸收光譜圖Fig.2 UV－Vis spectra of OC－HSA system T=298 K，c（HSA）=1×10-5 mol/L，c（OC）=0，0.25，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9（×10-5）mol/L for curves 1 to 12

2.3 OC與HSA作用的熒光光譜

在天然構象中，HSA結構中的氨基酸殘基可以產生內源熒光，其中產生最大熒光強度的是色氨酸殘基（Trp）。因此，HSA結構域IIA中僅包含一個Trp殘基（Trp214）的獨特性質可以作為研究該結構域中局部微環境變化和蛋白質藥物結合特性的內在探針。如圖3所示，不同溫度下HSA的熒光強度隨著OC濃度的增大而變大，并伴隨著明顯的藍移。通常認為熒光發射的藍移意味著熒光團周圍的環境變得更加疏水，而熒光發射的紅移意味著熒光團的暴露，周圍的環境變得更加親水［10，27－28］。圖3結果表明OC分子可能結合在亞結構域IIA中，使部分二級結構打開，暴露HSA的疏水腔，從而使蛋白質的微環境比其天然狀態更具疏水性。此外，Trp214殘基微環境的變化表明HSA與藥物結合后可能形成更緊湊的結構。

圖3 HSA與不同濃度OC在不同溫度下相互作用的熒光光譜Fig.3 The fluorescence spectra of different concentrations of HSA with OC at different temperatures

2.4 OC與HSA作用的同步熒光光譜

通過同步熒光法選取合適的波長差使重疊的峰分開，從而判斷蛋白質中氨基酸殘基的極性和微環境變化。Δλ=60 nm表示色氨酸殘基的熒光光譜，Δλ=15 nm代表酪氨酸殘基的熒光光譜［29］。如圖4A所示，隨著OC濃度的增大，最大發射峰強度逐漸增強，并表現為藍移，表明色氨酸殘基的外環境極性減小，疏水性增大，該結論與從紫外可見吸收光譜以及熒光光譜中獲得的結論非常吻合。而圖4B光譜圖的峰形未發生改變，說明酪氨酸殘基的外環境未發生顯著改變。

圖4 OC－HSA體系的同步熒光光譜圖Fig.4 Synchronous fluorimetry emission spectra of HSA upon addition of different concentrations OC

2.5 OC與HSA相互作用的結合常數

假設蛋白質與藥物作用過程中存在單一結合位點，根據熒光增強方程［30-31］：

式中：F0為HSA的熒光強度；F為藥物結合后的熒光強度；F∞為藥物結合達飽和的熒光強度；Q為藥物濃度；K為結合常數。以1/ΔF（y）對1/Q（x）作圖（圖5），直線斜率的倒數值即為K。OC－HSA體系熒光增強的雙倒數圖具有明顯的線性，說明溫度對兩者間作用的K影響較小，且在不同溫度下K值均較大（表1），說明兩者結合穩定。

表1 不同溫度下OC與HSA的結合常數Table 1 Binding constants of OC－HSA at different temperatures

圖5 OC－HSA體系在不同溫度下的熒光增強曲線Fig.5 Fluorescence enhancement curves for OCHSA system at different temperatures

2.6 OC與HSA的鍵和模式

根據Gibbs－Helmholtz方程［31］可以推斷出配體與生物大分子之間相互作用的方式：

式中：K表示平衡常數；T表示溫度；ΔH表示焓變；R表示摩爾氣體常數；ΔG表示吉布斯自由能；ΔS表示熵變。焓變ΔH在溫度變化不大的條件下可作為常數。由表2可知，將一定量的OC加入到HSA溶液中時可獲得負的ΔH和正的ΔS，表明OC與HSA間存在靜電和疏水作用力［32］。但是，靜電力通常伴隨著接近零的ΔH值。本研究中獲得的ΔH為負值表明HSA與OC之間沒有靜電作用力。另一方面，ΔH為負可歸因于范德華力以及OC與HSA極性氨基酸殘基之間的氫鍵［32－33］。因此，疏水力、范德華力以及氫鍵被認為是穩定HSA－OC復合物的主要作用力［28，32］。

表2 不同溫度下OC與HSA相互作用的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters of OC－HSA at different temperatures

2.7 OC的表面增強拉曼光譜

如圖6所示，AuNPs對OC的拉曼信號有明顯的增強作用。參考文獻［34－37］并結合OC理論拉曼光譜（Theoreticala）對OC分子的譜峰進行歸屬。其NRS光譜中598 cm-1處為C—N—C的面外彎曲振動；715 cm-1處的峰由甲氧基伸縮振動引起；1 331 cm-1處由C—H面內彎曲振動引起。在OC的SERS光譜中，598、682、792 cm-1處的面外振動模式峰未增強，甚至消失，而面內彎曲振動（1 158 cm-1）和苯環面內變形振動（1 579 cm-1）顯著增強。由表面選擇定則可知：垂直方向的振動模式被顯著增強，平行基底表面的振動模式增強較小，表明OC以垂直方式在基底表面吸附。此外，983 cm-1處的SERS譜峰對應于C—O—C的伸縮振動，該振動在NRS中是一個弱峰，而在SERS譜圖中明顯增強，再次表明分子以垂直方式結合于基底表面。OC的SERS譜圖中位于1 158 cm-1處的C—O—H剪式振動模式增強，表明OC可能以—O-形式吸附在AuNPs表面。圖6中苯環骨架振動特征峰出峰特別明顯，原因在于，OC分子中的苯環是一個大π鍵的共軛體系，與基底結合時周圍的π電子發生化學吸附，受苯環π電子的影響，OC分子牢牢地吸附在AuNPs表面，從而增大了拉曼信號。

圖6 OC的SERS光譜Fig.6 Surface-enhance Raman spectroscopy of OC

2.8 OC與HSA作用的表面增強拉曼光譜

圖7顯示，HSA在AuNPs基底中的振動峰強度不大，OC－HSA相互作用的結合方式和空間取向可通過與HSA識別前后OC分子SERS譜圖的變化進行分析。OC與HSA相互作用后的光譜峰強度顯著降低，信噪比較差，說明兩者發生了強烈的相互作用。在OC的SERS譜圖中，存在甲氧基伸縮振動峰（712 cm-1）和983 cm-1處C—O—C的伸縮振動（圖6），而與HSA作用后，這兩個振動峰的相對強度降低，表明OC分子可能以甲氧基團嵌入到HSA的疏水位點中。此外，OC－HSA的C—H面外彎曲振動（695 cm-1和827 cm-1）和骨架伸縮振動峰以及面內彎曲振動峰均有所增強，表明與HSA結合后，表面OC在AuNPs上的空間取向發生了變化。但C—O—H剪式振動峰（1 164 cm-1）被顯著增強，表明OC與HSA作用前后，以—O-形式吸附在AuNPs表面，吸附方式由垂直吸附轉變為傾斜吸附。

3 結 論

本文在模擬生理條件下通過多種光譜法對OC與HSA的相互作用進行研究，以了解藥物結合作用誘導的蛋白質微環境變化。熒光光譜結果表明，OC分子能夠進入色氨酸殘基附近的亞結構域IIA疏水空腔內部。通過過程熱力學參數研究和分析，得出OC與HSA分子之間的作用力主要是氫鍵、范德華力和疏水作用力。這些相互作用導致OC－HSA復合物的形成，使蛋白質的局部微環境比其原生狀態更疏水。最后以AuNPs作為增強基底，通過比較與HSA識別前后OC分子的SERS譜圖的變化情況，推斷OC分子以甲氧基作用于HSA的疏水腔中。該研究為進一步探索OC在體內的轉運、代謝、排泄，以及藥用科學性、合理性的發展等提供了一定的理論依據，對于闡明OC作用機理，揭示藥物藥效的實質以及生物體系內主客體識別的化學本質具有重要意義。