超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)人血清中4種內(nèi)源性皮質(zhì)激素

張 凡，于智睿，李明珠，喬 斌*

（1.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350；2.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津 300308）

皮質(zhì)激素是一類具有21個(gè)碳原子（孕烷）的化合物，分為糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素。人體內(nèi)以皮質(zhì)醇（F）、皮質(zhì)酮（CORT）、可的松（COR）和醛固酮（ALD）最為常見［1－2］，雖其含量極低，卻在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、應(yīng)激反應(yīng)等生理活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，是內(nèi)分泌、生理和病理學(xué)診斷的重要參考依據(jù)［3－4］。如臨床上通過檢測(cè)血清中F評(píng)估腎上腺功能不全病癥，早晨血清中F水平低于30 ng/mL可診斷為腎上腺功能不全，血清中F水平低于50 ng/mL可排除庫(kù)欣綜合癥［5］。血清中COR與F的比率反映了F向COR的總轉(zhuǎn)化，可用于評(píng)估11β-羥基類固醇脫氫酶的活性［6－7］。

高靈敏的超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC－MS/MS）在小分子臨床診斷中具有諸多優(yōu)勢(shì)，但血清等生物樣本中由于含有大量嚴(yán)重影響目標(biāo)物分離和電離效率的內(nèi)源性大分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等）及小分子干擾物，未經(jīng)復(fù)雜的樣品前處理不能直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)［5－6］。目前，常用的生物樣本前處理方法有固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）和蛋白沉淀（PPT）等方法［8－12］。隨著技術(shù)發(fā)展，近年還出現(xiàn)了超聲波輔助提取、蛋白鹽析、分散液液萃取、超分子萃取等新型前處理方法［7，13－14］。每種前處理技術(shù)均有優(yōu)缺點(diǎn)，前處理的選擇應(yīng)綜合考慮分析物的理化性質(zhì)、基質(zhì)特性、樣品預(yù)處理時(shí)間、可靠性以及成本等因素，有時(shí)需多種方法結(jié)合進(jìn)行［15－16］。由于血清中皮質(zhì)激素含量低且化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，如何建立特異性強(qiáng)、靈敏度高的人體內(nèi)皮質(zhì)激素檢測(cè)方法是目前臨床生化分析檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)，迫切需要開發(fā)一種快速、靈敏的血清中皮質(zhì)激素的樣品前處理及分析方法。

本文針對(duì)腎上腺內(nèi)分泌疾病常見檢測(cè)指標(biāo)，以人血清中ALD、F、CORT、COR 4種內(nèi)源性皮質(zhì)激素作為研究對(duì)象，采取蛋白鹽析沉淀－液液萃取（PPT－LLE）相結(jié)合的血清樣品前處理方法，建立同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法結(jié)合UPLC－MS/MS的皮質(zhì)激素分析方法。通過進(jìn)行前處理、色譜、質(zhì)譜等條件的優(yōu)化和方法學(xué)驗(yàn)證，以滿足臨床檢測(cè)高通量和高靈敏度的要求，為臨床對(duì)皮質(zhì)激素的定量監(jiān)測(cè)、內(nèi)分泌疾病以及與腎上腺有關(guān)疾病的診斷、人類機(jī)體調(diào)控機(jī)能和疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物代謝等研究提供助力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ－XS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；MS 3 basic渦旋混合儀（德國(guó)IKA公司）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；氮吹儀（艾杰爾科技有限公司）；萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽多利斯儀器公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm，美國(guó)Waters公司）。

甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；25%氨水（質(zhì)譜純，阿拉丁試劑有限公司）；ALD、F、CORT、COR標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司），內(nèi)標(biāo)物F－D4、ALD－D7、CORT－D4、COR－D7（美國(guó)Iso Sciences）；叔丁基甲基醚（色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司）；乙酸乙酯、二氯甲烷（色譜純，天津康科德科技有限公司）；硫酸鋅（優(yōu)級(jí)純，天津元立化工有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli Q超純水。

血清樣品來自天津市某醫(yī)院門診及住院患者，樣本的收集及使用已取得醫(yī)院許可并符合相關(guān)規(guī)定，患者血清樣本共27例，外觀澄清，無(wú)溶血、黃疸及脂血，于－80℃冷凍保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取ALD、F、CORT、COR對(duì)照品10.0 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中；皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 ng/mL）：準(zhǔn)確量取皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，用空白血清稀釋為1 ng/mL皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)樣本；同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100 ng/mL）：準(zhǔn)確量取F－D4、ALD－D7、CORT－D4、COR－D7母液（100μg/mL）10μL于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容。

標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于－20℃保存，備用。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確移取100μL血清于1.5 mL離心管中，分別加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液、5μL 0.3 mol/L的硫酸鋅溶液以及1 000μL叔丁基甲基醚。渦旋振蕩5 min，9 000 r/min離心1 min，使蛋白完全沉淀。取800μL上清液，氮吹至干后，用100μL 50%的甲醇水溶液復(fù)溶，待上機(jī)檢測(cè)。

1.4 UPLC－MS/MS的測(cè)定條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm），柱溫30℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2μL。流動(dòng)相組成：A相：0.01 mmol/L氨水，B相：乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，40%B；0.5～3.0 min，40%～95%B；3.0～4.0 min，95%B；4.0～4.1 min，95%～40%B；4.1～5.0 min，40%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正負(fù)離子快速切換掃描模式（CORT、F、COR為ESI+模式，ALD為ESI－模式），毛細(xì)管電壓：3.0 kV（ESI+）、1.0 kV（ESI－）；錐孔電壓：35 V（ESI+）、25 V（ESI－），錐孔氣流量：150 L/h，離子源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：600℃，脫溶劑氣流量：1 000 L/h，碰撞氣流速：0.18 mL/min；霧化氣壓力：0.7 MPa。采用多離子反應(yīng)監(jiān)控（MRM）掃描方式，各化合物的離子對(duì)參數(shù)如表1所示。

表1 4種皮質(zhì)激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of four corticosteroids

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜－質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI電離模式下，以自動(dòng)調(diào)諧的方式同時(shí)對(duì)100 ng/mL CORT、F、COR、ALD以及同位素混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，確定信號(hào)響應(yīng)較高的電離條件及MRM參數(shù)，優(yōu)化結(jié)果見表1。

優(yōu)化選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）色譜柱，以氨水－乙腈體系進(jìn)行梯度分離，比較了不同濃度（0、0.01、0.1、1 mmol/L）氨水對(duì)目標(biāo)物色譜響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，低濃度的NH4+可促進(jìn)［M+H］+的產(chǎn)生，使皮質(zhì)激素的質(zhì)譜響應(yīng)呈增大趨勢(shì)，但當(dāng)氨水濃度超過1 mmol/L時(shí)，過高的氨水濃度抑制了［M+H］+離子的形成，CORT和COR呈信號(hào)抑制現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)選擇0.01 mmol/L氨水－乙腈作為最佳流動(dòng)相。同時(shí)對(duì)流速、色譜柱溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定“1.4”色譜條件。利用優(yōu)化的色譜－質(zhì)譜條件對(duì)1 ng/mL皮質(zhì)激素和同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣檢測(cè)，各化合物的MRM色譜圖見圖1（色譜峰數(shù)值依次為保留時(shí)間、色譜峰面積），結(jié)果顯示信號(hào)良好、分離度高。

圖1 皮質(zhì)激素在MRM模式下的子離子色譜圖Fig.1 Product ion chromatograms of corticosteroids under MRM mode

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

提取溶劑選擇是人血清樣品處理的關(guān)鍵。理想的人血清樣本中皮質(zhì)激素的提取溶劑需與樣品基質(zhì)具有良好的相溶性，對(duì)目標(biāo)物的溶解度高，對(duì)其他干擾雜質(zhì)的溶解度小，且需具有一定的脫蛋白能力，才能有效釋放目標(biāo)組分。皮質(zhì)激素的樣品前處理常規(guī)采用LLE法，通過對(duì)比乙酸乙酯、二氯甲烷和叔丁基甲基醚對(duì)皮質(zhì)激素的提取效率（如圖2A），顯示叔丁基甲基醚的提取效率最高，從而確定其為第一提取劑。

2.2.2沉淀劑的選擇

采用LLE和PPT結(jié)合對(duì)樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，以叔丁基甲基醚為第一提取劑，考察其分別與沉淀劑乙酸乙酯、二氯甲烷和硫酸鋅進(jìn)行不同組合時(shí)，對(duì)血清中4種皮質(zhì)激素提取效率的影響（見圖2B）。結(jié)果顯示，硫酸鋅－叔丁基甲基醚對(duì)皮質(zhì)激素的提取效率最高，且高于叔丁基甲基醚單獨(dú)提取，這是由于血清樣品的基質(zhì)復(fù)雜，存在大量脂質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等化合物，硫酸鋅的加入具有沉淀蛋白的作用，使得目標(biāo)化合物能夠被有效釋放。此外，鹽析蛋白沉淀劑還可以改善溶劑的提取環(huán)境，提高皮質(zhì)激素的萃取效率。因此，綜合4種皮質(zhì)激素在血清中的提取效果，實(shí)驗(yàn)選擇叔丁基甲基醚－硫酸鋅作為最佳提取溶劑。

圖2 不同萃取劑（A），及不同萃取劑與沉淀劑組合（B）對(duì)血清中4種皮質(zhì)激素提取效率的影響Fig.2 Effects of different extractants（A），and combinations of extractants and precipitants（B）on extraction efficiencies of four corticosteroids in serum

2.2.3提取劑與沉淀劑體積的優(yōu)化

提取劑體積對(duì)人血清皮質(zhì)激素的提取效率有較大影響，如果體積過小，則提取不完全，導(dǎo)致目標(biāo)物的提取回收率降低；如果提取劑體積過大，則造成有機(jī)溶劑浪費(fèi)，且加長(zhǎng)氮?dú)獯蹈蓵r(shí)間。對(duì)不同體積（400、600、800、1 000、1 200μL）叔丁基甲基醚提取劑的影響進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，當(dāng)叔丁基甲基醚為1 000μL時(shí)，皮質(zhì)激素的提取效率最高，CORT、COR、F和ALD的提取效率分別為87.8%、72.7%、79.5%和70.2%，繼續(xù)增加叔丁基甲基醚體積，提取效率無(wú)明顯增長(zhǎng)。因此，選擇叔丁基甲基醚的最佳體積為1 000μL。

進(jìn)一步考察不同鹽析蛋白沉淀劑體積（0、5、10、15、20μL）對(duì)血清中皮質(zhì)激素提取效率的影響。結(jié)果顯示，硫酸鋅溶液體積為5μL時(shí)提取效果最好，CORT、COR、F和ALD的提取效率分別為87.8%、81.6%、79.5%和70.2%。實(shí)驗(yàn)最終確定以5μL 0.3 mol/L硫酸鋅溶液以及1 000μL叔丁基甲基醚相結(jié)合的鹽析蛋白沉淀－液液萃取前處理方法。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

通過比較空白血清提取液加標(biāo)后的響應(yīng)值和純標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)值確定基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度和評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。按照公式ME（%）=B/A×100%進(jìn)行絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算，ME為85%～115%時(shí)表明為無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，小于85%或大于115%時(shí)表明存在離子抑制或離子增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)以50%甲醇－水作為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度（0.1、1.0、10.0 ng/mL）皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得皮質(zhì)激素色譜峰面積（A）。對(duì)空白血清按照“1.3”進(jìn)行前處理操作，氮吹至干，分別加入0.1、1.0、10.0 ng/mL皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)檢測(cè)，測(cè)得皮質(zhì)激素色譜峰面積（B），每質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度皮質(zhì)激素質(zhì)控樣本的基質(zhì)效應(yīng)為85.9%～108%，表明血清樣本經(jīng)前處理后能顯著降低基質(zhì)效應(yīng)，在可接受無(wú)基質(zhì)效應(yīng)范圍內(nèi)，滿足檢測(cè)要求。平行樣本間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于11%，表明方法具有較高的重現(xiàn)性。

表2 血清中皮質(zhì)激素檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of corticosteroids in serum

2.3.2線性關(guān)系、檢出限與定量下限

采用空白血清配制含1 ng/mL同位素內(nèi)標(biāo)的一系列皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.05、0.02、0.01、0.005 ng/mL）。經(jīng)樣品前處理后上機(jī)檢測(cè)，測(cè)得ALD的定量下限（S/N=10）為50 pg/mL，檢出限（S/N=3）為20 pg/mL，其他3種目標(biāo)物的定量下限均為20 pg/mL，檢出限為10 pg/mL，方法具有較高靈敏度。以皮質(zhì)激素的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行擬合，構(gòu)建4種皮質(zhì)激素的校正曲線。得到ALD的線性范圍為0.05～20 ng/mL，回歸方程為y=0.267 1x+3.303 4；F、CORT和COR的線性范圍為0.02～20 ng/mL，回歸方程分別為y=0.053 2x+2.459 2、y=0.095 8x+0.824 9、y=0.619 4x+20.738 4。4種皮質(zhì)激素的線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.995。

2.3.3回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

回收率包括提取回收率和方法回收率，表示分析方法從生物基質(zhì)中提取分析物的效率，常用于評(píng)估樣品制備方法從生物基質(zhì)中提取分析物的能力。

2.3.3.1提取回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差用空白血清配制含1 ng/mL同位素內(nèi)標(biāo)的血清皮質(zhì)激素質(zhì)控樣本（0.1、1.0、10.0 ng/mL），對(duì)樣本進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測(cè)（n=3），測(cè)得色譜峰面積A。用50%甲醇水溶液配制含1 ng/mL同位素內(nèi)標(biāo)的皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品（0.1、1.0、10.0 ng/mL），上機(jī)檢測(cè)（n=3），測(cè)得色譜峰面積B。根據(jù)公式：R=A/B×100%計(jì)算得到樣本提取回收率。連續(xù)3日內(nèi)重復(fù)提取回收率實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察。結(jié)果顯示，皮質(zhì)激素的提取回收率為55.5%～90.8%，內(nèi)標(biāo)回收率均在60%以上，目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的提取回收率相近，且日內(nèi)RSD和日間RSD分別不大于13%和18%（見表3），表明該前處理方法具有良好的提取效果和重復(fù)性。

表3 提取回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of extraction recovery

2.3.3.2方法回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差方法回收率（R R）通過計(jì)算各濃度點(diǎn)質(zhì)量控制（QC）樣品的平均實(shí)測(cè)濃度（xˉ）與標(biāo)示濃度S（QC樣品的理論濃度）的比值獲得，即R R=xˉ/S×100%。以空白血清配制含1 ng/mL同位素內(nèi)標(biāo)皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)樣本（20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005 ng/mL），對(duì)樣本進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取含有1 ng/mL同位素內(nèi)標(biāo)的血清皮質(zhì)激素質(zhì)量控制樣本（0.1、1.0、10.0 ng/mL），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法得到相應(yīng)的測(cè)定濃度，計(jì)算方法回收率。結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本的方法回收率為91.0%～101%。方法的日內(nèi)RSD為0.40%～12%，日間RSD為2.6%～13%。表明方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度（見表4）。

表4 方法回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of method recovery

2.4 實(shí)際血清樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)27例真實(shí)健康人血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，4種內(nèi)源性皮質(zhì)激素均有檢出（表5）。結(jié)果顯示，27例人血清中CORT、COR、F、ALD的質(zhì)量濃度分別為0.73～8.41 ng/mL、10.91～19.62 ng/mL、100.41～319.12 ng/mL和10.18～236.57 pg/mL。由于成年人血清中CORT的正常值范圍為0.53～15.60 ng/mL［17－18］，COR為7.2～59 ng/mL［19］，總F水平為50～250 ng/mL［20］，ALD為10～210 pg/mL［21］，本方法所測(cè)27例人血清樣品中皮質(zhì)激素的含量多數(shù)處于正常值范圍。本方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表5 健康人血清中皮質(zhì)激素的測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of corticosteroids in healthy human serum

3 結(jié) 論

本文建立了蛋白沉淀－液液萃取前處理，UPLC－MS/MS檢測(cè)血清樣品中內(nèi)源性皮質(zhì)激素的分析方法。該方法無(wú)需衍生化和復(fù)雜步驟，易于實(shí)現(xiàn)高通量處理，且以同位素做內(nèi)標(biāo)，提高了方法的準(zhǔn)確度、特異性及靈敏度。該方法具有較高的實(shí)用性，可用于臨床血清樣本中內(nèi)源性皮質(zhì)激素的檢測(cè)。