阿爾茨海默病及輕度認(rèn)知功能障礙患者單核細(xì)胞的Aβ42吞噬功能研究

梁慶華 利榮喬 何本進(jìn)（廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院，南寧 530021）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是引起進(jìn)行性癡呆的主要病因，在人腦皮層和邊緣區(qū)中存在β 淀粉樣蛋白（amyloid-beta，Aβ）斑塊的細(xì)胞外聚集和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)形成，由過度磷酸化的tau 蛋白組成，其中β-淀粉樣多肽1-42（β-amyloid 42，Aβ42）是AD 腦內(nèi)Aβ 沉積最具特征性的表現(xiàn)，Aβ42 沉積可形成老年斑，造成神經(jīng)元變性和死亡［1-2］，而有效清除腦內(nèi)Aβ沉積是目前治療AD 亟待解決的關(guān)鍵問題。在AD 患者腦內(nèi)Aβ 沉積的血管周圍部位和老年斑中心存在吞噬Aβ 血液或骨髓來源的吞噬細(xì)胞浸潤，通過招募更多的包括單核細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的單核吞噬細(xì)胞在Aβ 清除方面發(fā)揮重要功能［3-5］。研究表明，AD 患者外周血單核細(xì)胞分化為吞噬細(xì)胞的能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞更易凋亡和衰老。輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）是正常老化過程并向早期老年癡呆的一種過渡階段，主要表現(xiàn)為輕度智能和記憶減退［4］。目前AD 及MCI的發(fā)生、發(fā)展及衰老過程中單核細(xì)胞中Aβ 吞噬功能的變化尚不清楚［5-7］。因此，本研究擬探討AD 患者及MCI 患者血液中單核細(xì)胞的Aβ42 吞噬功能，以期闡明AD 在衰老發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為AD的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集2016年12月至2019年12月廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院收治的AD 患者（AD 組）、MCI患者（MCI組）和體檢健康志愿者（NC組）各56例。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合AD 及MCI 診斷的患者，MCI 及AD按美國國立語言障礙卒中研究所與AD 及相關(guān)疾病協(xié)會（NINCDS-ADRDA）標(biāo)準(zhǔn)診斷［8］，AD 存在持續(xù)進(jìn)展的情景記憶障礙，超過6 個月。MCI 表現(xiàn)為輕度記憶力下降、智能減退，根據(jù)簡易智能狀態(tài)檢測量（MMSE）和蒙特利爾認(rèn)知評估量表（MoCA）評分標(biāo)準(zhǔn)，MMSE：21～26 分和MoCA：20～25 分；排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心肺腎功能損傷者、合并急性單核細(xì)胞白血病、骨髓異常增生等血液類疾病者、存在免疫系統(tǒng)疾病者、嚴(yán)重感染者、其他原因引起認(rèn)知功能障礙者。3 組間年齡、性別、既往史、血常規(guī)、血脂、血糖、甲狀腺素、尿酸、尿素氮等實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 ELISA 試劑盒（美國Covance）；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀（美國Bioscience）；離心機(jī)（德國Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 單核細(xì)胞中Aβ42 吞噬功能測定 抽取靜脈血10 ml，2 000 r/min 離心20 min，吸取上層血漿（備用），加淋巴細(xì)胞分層液，離心后收集外周血單個核細(xì)胞，加入RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加Aβ42-FTIC 抗體孵育過夜，棄上清，消化為單細(xì)胞，加PBS清洗3 次后離心，棄上清，加入帶FITC 的二抗孵育30 min，在抗體染色前封閉20 min，洗滌后，加入100 μl FACS 洗滌液，再加入相應(yīng)的CD14、CD16 抗體，4℃孵育30 min，4%多聚甲醛中固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀中進(jìn)行單核細(xì)胞總Aβ42 熒光強(qiáng)度測定，根據(jù)CD14 和CD16 表達(dá)量可分為CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+3 個亞群，最后獲取各細(xì)胞亞群中內(nèi)吞Aβ42 的熒光圖，記錄各單核細(xì)胞亞群的Aβ42表達(dá)的絕對值。

1.2.2 腦脊液及血液中Aβ42 的測定 收集所有研究對象血液中血漿及腦脊液標(biāo)本，ELISA 法在酶標(biāo)儀中測定Aβ42 濃度，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，LSD-t法進(jìn)行兩組間比較，采用Pearson相關(guān)分析驗(yàn)證血液、腦脊液中Aβ42 含量與單核細(xì)胞Aβ 吞噬功能的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血液單核細(xì)胞中Aβ42 的吞噬功能 經(jīng)流式分析，可見單核細(xì)胞群前角散射（FSC-H）和側(cè)角散射（SSC-H）（圖1A），根據(jù)前角散射面積（FSC-A）和前向角散射高度（FSC-H）粘連細(xì)胞（圖1B），可根據(jù)CD14和CD16 表達(dá)量不同計算出單核細(xì)胞亞群CD14+CD16-（圖1C1）、CD14+CD16+（圖1C2）和CD14-CD16+（圖1C3）的絕對計數(shù)，與NC 組和MCI 組相比，AD 患者總單核細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群（CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+）的Aβ42 吞噬功能顯著降低（P＜0.05），而MCI 組和NC 組間下降差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 血液單核細(xì)胞亞群的Aβ42功能比較（）Tab.1 Comparison of Aβ42 function of blood monocyte subsets（）

表1 血液單核細(xì)胞亞群的Aβ42功能比較（）Tab.1 Comparison of Aβ42 function of blood monocyte subsets（）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

圖1 流式分析圖Fig.1 Flow analysis diagram

2.2 不同年齡組AD 患者血液單核細(xì)胞中Aβ42 吞噬功能分析 根據(jù)20～45 歲、46～65 歲、和66～80 歲年齡度分組，隨著年齡增長，AD 患者外周血總單核細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群（CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+）的Aβ42 吞噬功能明顯降低（P均＜0.05），其中單核細(xì)胞亞群CD14+CD16-下降最為明顯，見表2。

表2 不同年齡組AD患者外周血單核細(xì)胞的Aβ42功能（）Tab.2 Aβ42 function of peripheral blood monocytes in AD patients of different age groups（）

表2 不同年齡組AD患者外周血單核細(xì)胞的Aβ42功能（）Tab.2 Aβ42 function of peripheral blood monocytes in AD patients of different age groups（）

2.3 血液和腦脊液中Aβ42水平 與NC組和MCI組相比，AD 患者血液和腦脊液中Aβ42 水平明顯降低（P＜0.05），MCI 組和NC 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 血液和腦脊液中Aβ42水平比較（xˉ±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of Aβ42 level in blood and cerebrospi?nal fluid（xˉ±s，pg/ml）

2.4 血液單核細(xì)胞Aβ42 與血液和腦脊液中Aβ42水平的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析表明，外周血中單核細(xì)胞亞群CD14+CD16-、CD14+CD16+與血液Aβ42 水平呈正相關(guān)（r=0.412，P=0.012；r=0.356，P=0.032），而與腦脊液Aβ42 水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；外周血中單核細(xì)胞CD14-CD16+亞群與血液和腦脊液中Aβ42水平的無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

AD 主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶下降、神經(jīng)認(rèn)知功能障礙、精神行為異常等癥狀，65 歲以上人群高發(fā)，是一種呈漸進(jìn)性進(jìn)展、無法治愈的致命的神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致老年癡呆的最常見原因。AD 的早期病理改變涉及大腦和視網(wǎng)膜中Aβ42 的積累，而Aβ42 淀粉樣蛋白清除障礙是導(dǎo)致散發(fā)型AD 患者的主要原因［6，9-10］。腦內(nèi)Aβ 的動態(tài)平衡除了與Aβ代謝調(diào)節(jié)有關(guān)外，還與外周血液及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血腦屏障動態(tài)交換有關(guān)［9，11］。目前尚無特性治療方法，而清除腦內(nèi)Aβ 功能對AD 的治療十分重要。目前有關(guān)單核細(xì)胞的Aβ 吞噬功能在MCI 及AD 中的具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究初步探討AD、MCI 和對照組患者中血液中單核細(xì)胞的Aβ42吞噬功能，為AD的診治提供臨床證據(jù)。

單核細(xì)胞等固有免疫系統(tǒng)與AD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，單核細(xì)胞可參與機(jī)體防御，能有效識別、殺傷和清除病原菌、腫瘤細(xì)胞和死亡細(xì)胞［5-7］。另外，外周血單核細(xì)胞是組織抗原提呈細(xì)胞、成骨細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，由骨髓象中髓單核干細(xì)胞分化并釋放入血而來，通過細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD14 和CD16）表達(dá)差異可分為3 個細(xì)胞亞群，非經(jīng)典型亞群：低表達(dá)CD14，高表達(dá)CD16（CD14-CD16+）、中間型亞群（CD14+CD16+），經(jīng)典型亞群（CD14+CD16-）等單核細(xì)胞亞群［3，5］。本研究通過比較不同認(rèn)知狀態(tài)下血液中單核細(xì)胞Aβ 吞噬功能，發(fā)現(xiàn)與NC 組和MCI 組相比，AD 組總單核細(xì)胞群及單核細(xì)胞亞群CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+的Aβ42 吞噬功能明顯降低，而MCI 組和NC 組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示AD患者血液中單核細(xì)胞的Aβ42吞噬功能下降，間接引起Aβ42 在腦內(nèi)大量沉積，參與AD 的發(fā)生發(fā)展，而在MCI 階段，外周血的單核細(xì)胞Aβ 吞噬功能并無明顯下降。有研究表明，年齡與AD 的發(fā)生密切相關(guān)，隨著年齡增長，AD 患病率逐漸增加，腦內(nèi)Aβ42沉積越明顯［10-11］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長，CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+亞群Aβ42吞噬功能逐漸降低，說明單核細(xì)胞Aβ42 識別和吞噬功能隨著年齡增長逐漸下降，提示在AD 衰老過程中血液單核細(xì)胞Aβ42 吞噬功能下降，是促進(jìn)AD 患者Aβ42 在腦內(nèi)沉積的主要原因之一［7，12］。另外，本研究表明血液和腦脊液中Aβ42 水平明顯下降，在腦脊液中尤為明顯，可能與AD 患者腦內(nèi)Aβ42 大量沉積導(dǎo)致分泌在腦脊液和外周血中的Aβ42 減少有關(guān)，提示單核細(xì)胞Aβ42 吞噬功能的減弱，Aβ42 清除降低可進(jìn)一步導(dǎo)致Aβ42 沉積，參與AD 發(fā)病的免疫調(diào)控機(jī)制［7］。

本研究中，CD14+CD16-和CD14+CD16+亞群的Aβ42 吞噬功能與血液Aβ42 水平呈正相關(guān)，而與腦脊液Aβ42 無明顯相關(guān)性，表明單核細(xì)胞在外周血液中Aβ 的清除功能發(fā)揮重要作用，但對腦脊液的清除能力尚弱。Aβ清除包含中樞和外周途徑，中樞途徑是腦內(nèi)Aβ 通過Aβ 降解酶降解和小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬，而外周途徑是Aβ 經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血循環(huán)清除，外周血清除障礙可導(dǎo)致Aβ 沉積，加快AD 病程進(jìn)展［9，11，13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者外周單核細(xì)胞在外周血循環(huán)和腦內(nèi)Aβ 清除功能上發(fā)揮重要作用，其可能機(jī)制是患者腦內(nèi)的Aβ 從血腦屏障通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（LRP1）轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血循環(huán)，外周血循環(huán)Aβ 通過糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)，而外周血循環(huán)中Aβ 的清除能力能間接影響腦內(nèi)Aβ 水平［9-10，16-17］。本研究中腦脊液Aβ 水平可間接反映腦內(nèi)Aβ 水平，因此今后需進(jìn)一步探討血液單核細(xì)胞Aβ42 吞噬功能如何對腦內(nèi)Aβ42 沉積產(chǎn)生影響，為闡明Aβ 清除及沉積的機(jī)制提供較為充足的理論證據(jù)。

綜上，AD 患者血液中單核細(xì)胞的Aβ42 吞噬功能下降，隨著年齡增長，AD 患者外周血總單核細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群（CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+）的Aβ42 吞噬功能明顯降低，進(jìn)而導(dǎo)致血液和腦脊液中Aβ42 水平沉積明顯升高，腦脊液中Aβ42 沉積更為明顯，引起腦脊液和血液中游離Aβ42水平降低，且血液中CD14+CD16-和CD14+CD16+亞群的Aβ42 吞噬功能與血液Aβ42 水平沉積呈正相關(guān)，提示外周血單核細(xì)胞Aβ42 吞噬功能下降在AD 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，為AD 的診治提供了新的潛在靶點(diǎn)。