馬爾堡病治療和預防研究進展①

王歆瑋 張妤亭 鄭源強 石艷春 陳國江（內蒙古醫科大學內蒙古自治區分子生物學重點實驗室，呼和浩特 010058）

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）是人類馬爾堡?。∕arburg disease，MARD）的病原體，病死率23%～90%［1-2］。MARV是絲狀病毒科（Filoviridae）的一員，絲狀病毒科主要由馬爾堡病毒屬（Marburgvirus）、埃博拉病毒屬（Ebolavirus）組成［2-3］。馬爾堡病毒屬包括馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）和拉文病毒（Ravn virus，RAVV）兩個亞型［4-5］，MARV 主要有Angola、Musoke 和Ci67 等分離株［6］。最近的一次馬爾堡病毒疫情發生在2021 年8 月，幾內亞東南部發現了馬爾堡出血熱確診的死亡病例。

MARV 具有非分段負義RNA 基因組，編碼7 種結構蛋白，從3'至5'依次為核衣殼蛋白（nucleoprotein，NP）、病毒蛋白（viral protein，VP）VP35、VP40、糖蛋白（glycoprotein，GP）、VP30、VP24 以及RNA 依賴的RNA 聚合酶L［7］。其中GP 蛋白作為MARV 唯一表面蛋白，能介導病毒與靶細胞的黏附以及病毒的進入［8］。MARV 糖蛋白基因包含一個編碼全長GP 的開放閱讀框（open reading frame，ORF），在內質網中合成后，前體GP 被反式高爾基體網絡中的Furin 蛋白酶在435 位氨基酸位點處水解切割，產生兩個二硫鍵連接的亞基，GP1和GP2［9］。由GP1形成的胞外結構域介導與受體的結合，而GP2 上含有融合肽，能介導病毒與細胞膜的融合［8］。MARV 通常通過直接接觸受感染者的血液或其他體液（唾液、尿液、汗液等）而透過損傷皮膚或黏膜進入人體［10］。單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原提呈細胞是MARV 感染的早期目標［11］，這些被感染的細胞通過淋巴液或血液將病毒傳播至周圍淋巴結、肝臟和脾臟等富含單核/巨噬細胞的多個組織和器官進行復制［12-13］，促使受感染的單核/巨噬細胞釋放大量促炎細胞因子（IL-6、IL-8、IL-15 和IL-16）、趨化因子和生長因子（巨噬細胞炎癥蛋白MIP-1、單核細胞集落刺激因子、M-CSF、單核細胞趨化蛋白MCP-1）從而誘發全身炎癥反應［14］。同時病毒本身會抑制人體Ⅰ型干擾素的分泌，而干擾素是機體抗病毒感染免疫的主要效應分子。在病毒感染晚期，血管內皮細胞是MARV 感染的主要靶細胞，內皮細胞通透性增加和毛細血管受損可能與MARV 在內皮細胞中的復制有關［13，15］，這也是馬爾堡病毒病發生出血癥狀的主要原因。此外，淋巴細胞雖不是MARV 感染的主要目標，但在感染者的淋巴組織中，腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和一氧化氮（NO）的表達增加，改變淋巴細胞生存微環境，導致淋巴細胞和自然殺傷細胞大量凋亡［14］。

MARV 既是一種自然獲得性疾病，也是生化武器的潛在病原體，對全球健康構成嚴重威脅，馬爾堡病毒病的防治研究舉足輕重。MARV GP 的受體結合域（receptor binding domain，RBD）定位于GP1的38～188位氨基酸［16］，其中MARV 進入的一個重要步驟是內體蛋白酶水解GP1，促進受體結合域與內體進入因子Niemann-Pick C1（NPC1）蛋白的結合［8］。MARV 包膜糖蛋白GP 作為主要抗原，其RBD 區既為疫苗設計常用的序列，也是抗體識別的主要位點［17］。本文總結了MARD 潛在的預防與治療措施，包括疫苗、單克隆抗體、小分子藥物和小干擾RNA（siRNA）等。

1 馬爾堡病的預防性疫苗

自從MARV 被首次發現以來，科學家們就一直致力于MARV 等絲狀病毒的疫苗研究，但至今在世界范圍內都沒有獲得批準任何針對MARV 的疫苗。目前有三種候選馬爾堡疫苗（cAd3、MVA-BN-Filo和MARV DNA）正處于1 期臨床試驗。多個MARV 疫苗（腺病毒、DNA、rVSV、VLP）已在非人類靈長類動物（nonhuman primates，nHPs）中顯示出保護作用［18］。

1.1 腺病毒載體疫苗 現針對埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）已有幾種腺病毒疫苗，但針對MARV的腺病毒疫苗有限。重組腺病毒5 血清型（recom?binant adenovirus serotype 5，rAd5）是糖蛋白GP 疫苗最常用的載體。在一項研究中，給獼猴注射單劑量表達MARV-Angola GP 的rAd5 疫苗，4 周后給予同種MARV 攻擊，均未出現臨床癥狀，表明該疫苗對nHPs提供完全保護性免疫［19］。

復合腺病毒（the complex adenovirus，CAdVax）疫苗平臺使用5 種抗原：EBOV、SUDV、MARV（Musoke和Ci67）和RAVV的GP以及EBOV和MARVMusoke 的NP。研究人員采用初免-加強免疫策略（prime-boost strategy）對獼猴進行這種疫苗接種，并用EBOV、SUDV 和MARV-Musoke/Ci67株進行攻擊，它們產生了針對以上5 種絲狀病毒的抗體，所有動物均未出現臨床疾?。?0］。

但是，腺病毒載體疫苗的使用受到人群中預存免疫（preexisting immunity）的限制，為了解決這一問題，研究人員嘗試采用不太常見的血清型，并在動物模型中進行了口服或鼻腔疫苗接種。科學家們使用黑猩猩腺病毒3 型（chimpanzee Adenovirus 3，cAd3）載體及EBOV GP 制備疫苗，針對EBOV 攻擊顯示100%的保護作用［21］。cAd3 馬爾堡疫苗的1 期臨床試驗目前正在進行。

2016 年發表的MVA-BN-Filo 疫苗1 期臨床試驗采用與復合腺病毒疫苗相同的免疫策略，參與者沒有產生疫苗相關的嚴重不良反應，并且所有接種者在接種增強疫苗后第21 天和8 個月均可檢測到IgG水平［22］。

1.2 DNA 疫苗 絲狀病毒的DNA 疫苗在nHPs 試驗中具有良好的安全性，且易于生產，能誘導產生特異性免疫應答；但在臨床試驗中，這些疫苗的免疫原性有限［23-25］。將含有MARV-Musoke GP 和MARV-Angola GP 的DNA 疫苗在食蟹猴身上進行試驗，產生IgG 反應并保護其免受同種病毒攻擊，但是，所有動物都出現臨床癥狀，這表明僅有IgG 反應不能控制感染［19，26］。但將DNA 疫苗作為初免-加強免疫策略的一部分，先使用DNA 疫苗初次免疫，再用腺病毒載體疫苗加強免疫，能夠完全保護實驗動物。表 達MARV-Angola GP 的DNA 疫 苗（VRC?MARDNA025-00-VP）已完成1期臨床試驗。

1.3 重組水皰性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus，rVSV）載體疫苗 MARV rVSV 疫苗是一種重組的、具有復制能力的水皰性口炎病毒候選疫苗，將水皰性口炎病毒外膜糖蛋白基因替換為馬爾堡病毒糖蛋白基因，目前有幾種rVSV疫苗已經在nHPs 中進行研究［27］。用含有MARV、EBOV 和SUDV 3 種GP 的rVSV 載體疫苗免疫nHPs 后，所有3 種組分均能產生抗體免疫應答，且對MARV、EBOV、SUDV 和TAFV 均有100%的交叉保護作用，其中一只動物出現了可檢測到的病毒血癥［28］。另一項研究表明，在接種rVSV-MARV-GP疫苗14個月后仍可檢測到抗MARV GP 的IgG，且對MARV 的攻擊顯現出有效保護作用，這一結果也證明了rVSV載體疫苗的持久性［29］。rVSV 載體疫苗對于MARV 來說很有前景，目前還沒有進行臨床試驗。

1.4 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）疫苗馬爾堡VLP（MVLP）疫苗是基于MARV VP40 和GP制備的一種亞單位疫苗，產生的VLPs在形態上類似于Marburg 病毒粒子［30］。MARV-Musoke、Ci67 和RAVV 分離株的VLP 疫苗在nHPs 中進行了試驗，其對所有3種毒株均可產生抗體反應，4周后用MARV攻擊時，所有動物都表現出交叉保護作用［31］。

2 馬爾堡病的治療

目前多種抗馬爾堡病毒的藥物正在研發中，包括治療性疫苗、抗體療法、小分子藥物、脂質包裹的siRNA等。

2.1 治療性疫苗 以預防為目的的MARV 疫苗品類很多，但以感染病毒后的患者為治療對象的MARV 疫苗主要是以rVSV 為載體的疫苗。研究表明，一種表達MARV-Musoke GP 的rVSV 疫苗（rVSV ΔG/MARV-Musoke-GP）可充分保護恒河猴免受高劑量MARV-Musoke的致命攻擊。暴露后注射該疫苗，30 min 存活率為100%，24 h 存活率為83%，48 h 存活率為33%［32-33］。為了評估暴露后對最具致病性的MARV-Angola 突變株的療效，研究人員設計了表達同源的MARV-Angola GP 的rVSV 疫苗。獼猴受到高劑量（1 000 PFU）或低劑量（50 PFU）Angola 突變株的攻擊，并在暴露后20～30 min 接受治療。在高劑量和低劑量的攻擊下，分別有25%和60%～75%的治療獼猴幸存下來［34］，這也表明病毒載量與存活率相關。而在MARD 沒有其他有效治療的情況下，暴露后疫苗應該是保護實驗室和醫護人員免受感染的極佳選擇。

2.2 抗體療法 有研究表明，從一例MARV 幸存者的B 細胞中成功分離的一株中和性單克隆抗體，其識別區域為MARV GP1 上的NPC1 蛋白受體結合域，這提示了該抗體的主要機制可能是抑制GP1 與NPC1受體的結合［35］。

2.2.1 多克隆濃縮IgG 從MARV 攻擊中存活下來的nHPs 中分離濃縮的多克隆IgG，給MARV 攻擊后的恒河猴注射3 劑（100 mg/kg），可提供完全保護作用，無病毒血癥或臨床疾病，但動物產生了IgM 反應，77 d 后再次用MARV 攻擊顯示出完全保護。另一研究中，MARV攻擊后48 h靜脈注射給藥，隨后在第4 天和第8 天給藥，存活率100%，其中一只患上輕微疾?。?6］。

2.2.2 單克隆抗體 幾種單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）在小鼠感染模型展示了對MARV致死性攻擊的保護作用。在恒河猴暴露于MARV后第4 天和第7 天分別給予靜脈注射50 mg/kg 的人類單克隆抗體MR191-N，存活率100%。另一實驗表明該mAb 針對MARV 的攻擊存活率80%，針對RAVV 的存活率100%。接受治療的動物其異常的實驗室指標均有所改善，這使得mAb MR191-N成為治療和預防MARV 的潛在候選藥物。目前人體試驗尚未開展［37］。

2.3 小分子藥物

2.3.1 加利司韋（Galidesivir，BCX4430）BCX4430由美國BioCryst 制藥公司研發，為人工合成的腺苷類似物，通過一種非專一性RNA 鏈終止子來抑制病毒RNA 聚合酶功能，進而導致病毒所需蛋白不能表達，該藥屬于廣譜抗病毒藥，其作用機制是阻斷RNA 基因組的復制，抑制病毒繁殖［38］。實驗顯示BCX4430 可以抑制MARV 在體外培養的人類細胞中復制，此外，在MARV 攻擊食蟹猴后1 h、24 h 和48 h，肌注BCX4430（15 mg/kg）2次/d，1 h組存活率83%；24 h 和48 h 組存活率100%，接受治療的動物均未發現明顯的病毒感染癥狀，實驗室檢查指標均有所改善，而對照組全部死亡。該藥物的1 期臨床研究已于2016年結束，目前結果尚未發表［39］。

2.3.2 法匹拉韋（Favipiravir，T-705）T-705 由日本富山化工制藥公司研發，是一種新型的RNA 聚合酶抑制劑，主要通過阻斷病毒核酸復制的方式來抑制病毒繁殖，該藥對多種RNA 病毒具有廣譜抗病毒活性，已在日本被批準用于治療流感。已有研究表明，T-705 在小鼠模型中展示了對抗EBOV 的療效［40］。BIXLER 等［41］證明，從食蟹猴接受MARVAngola（1 000 PFU）攻擊當天開始，每日兩次靜脈注射T-705，持續14 d，存活率83%；但口服給藥沒有任何療效。

2.3.3 瑞德西韋（Remdesivir，GS-5734）GS-5734由美國吉利德科技公司研發，是一種腺苷類似物的前體藥物，具有體外抗MARV 活性。PORTER 等［42］已證明獼猴在感染MARV 后4～5 d 內，每日一次服用瑞德西韋5 mg/kg 或10 mg/kg，持續12 d，低劑量組存活率為50%，高劑量組存活率83%，證明該藥對感染MARV 的獼猴有效，且存在劑量依賴性。該藥已被成功用于治療nHPs 中的埃博拉病毒?。‥bola virus disease，EVD），曾在患埃博拉病的護士及嬰兒身上使用，證實可以提供保護作用［43-44］。

2.3.4 干擾素β（IFN-β）人類的EVD 與干擾素α的產生有關，患者血漿IFN-α 濃度遠遠超過其他病毒感染者（60～100 倍），但很少產生干擾素β。這一發現推進了在獼猴感染MARV 后注射IFN-β 的研究。早期用IFN-β 治療顯著延長了MARV 感染后的存活時間，但不影響病死率。根據現有的數據IFN-β 作為抗MARV 感染的單藥療法似乎前景不大，但有望作為MARV感染后的輔助治療［45］。

2.3.5 帶正電荷的磷酸二酯嗎啉基低聚物（phos?phorodiamidate morpholino oligomers，PMOs）PMOs是一類寡核苷酸類似物，通過空間位阻抑制mRNA翻譯，從而抑制病毒復制。發揮作用時，RNA 中的核糖堿基被結構類似的嗎啉基替代，亞甲基磷酸二酯鍵與mRNA 結合，進而阻止mRNA 翻譯，同時PMOs 添加哌嗪殘基提供一個正電荷，可以增強與帶負電荷的mRNA的親和力［38］。

研究人員制備了一種組合型PMOs 藥物AVI-6003，其為AVI-7287（靶向VP24 mRNA）與AVI-7288（靶向NP mRNA）的1∶1混合藥物，在MARV-Musoke株感染的恒河猴中，給藥AVI-6003顯示出完全保護作用。在一項nHPs 的研究中，暴露后30～60 min 內給予AVI-6003 10 mg/kg 時存活率50%，20 mg/kg 和30 mg/kg 具有100%的保護作用。但隨后的一項研究表明，AVI-7287 沒有觀察到生存益處或病毒滴度降低，而AVI-7288 具有抗病毒活性，其抑制NP 的合成，從而對病毒mRNA 的產生、病毒基因組復制和病毒組裝產生影響［46］。在食蟹猴感染模型中，分別在病毒攻擊后24 h、48 h 和96 h 開始，每日給藥15 mg/kg，持續14 d，保護效率依次為83%、100%和83%［47-48］。

在一項人體隨機對照試驗中，AVI-6003 在人體內以遞增劑量（0.05～4.5 mg/kg）給藥，30 名受試者耐受性良好，最常見的不良反應是胃腸道癥狀、頭痛和頭暈，有兩名受試者的ALT 和AST 出現1 級升高，8 名受試者的淀粉酶輕度升高［49］。隨后一項涉及40名健康志愿者的隨機對照試驗中，受試者每天接受1～16 mg/kg 劑量的注射，其中10 名參與者出現頭痛或其他輕微副作用，但未發現安全問題或嚴重不良反應事件。根據nHPs 和24 h 藥時曲線下面積推算出，人體保護劑量為9.6 mg/kg，而蒙特卡洛模擬支持的保護劑量為11 mg/kg［47］。

2.4 小干擾RNA（siRNAs）利用siRNA 抑制病毒基因表達是抗病毒研究的新興領域，并且是目前為數不多的具有前景的抗MARV 治療方法之一。siRNA 通過空間阻斷或觸發DNA/RNA 雙鏈的斷裂來干擾mRNA 翻譯。研究人員確定了一種靶向MARV NP 的siRNA（NP-718m），被脂質納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）包裹時，可在體外抑制MARV 的復制，同時可通過與內體膜融合而進入細胞，并在豚鼠體內對3 種馬爾堡病毒株（MARVAngola/Musoke、RAVV）表現出廣泛的保護作用［50］。在另一實驗中，對感染MARV的恒河猴進行NP-718-LNP 的進一步研究，使用致命劑量的MARV-Angola株攻擊后30～45 min、24 h、48 h 和72 h 靜脈注射NP718-LNP，所有接受治療的動物全部存活，而未經處理的對照組在感染后7至9 d內死亡，這表明該藥可在nHPs 中有效治療MARV-Angola 的感染［51］。目前至少有14種siRNAs進入臨床試驗。

3 總結

世界各地的科研人員已經對MARV 研究數十年，從病毒的流行病學、發病機制、傳播途徑以及預防治療等方面進行深入的探索，由于MARV 是高度致命的烈性傳染病病原體，可引起嚴重出血熱并迅速進展為感染性休克，被列為A級致命病原體，需要在生物安全4 級的實驗室開展研究，因此研究過程存在諸多困難和風險。目前尚無針對MARV 的預防性疫苗及抗病毒藥物上市。綜合考慮，預防性疫苗中腺病毒或rVSV載體疫苗是目前最有前景的；而mAb 作為治療MARV 的潛在首選治療方案正在進行臨床驗證，BCX4430 可能是除mAb 制劑（如MR-191-N）以外的第二選擇。需要注意的是，即使采取了上述治療方案，支持性護理——包括密切監測生命體征、液體復蘇、電解質和酸堿監測——也是必不可少的關鍵一環，同時必須積極應對可能的疫情，預防二次傳播和散發性感染，一旦發現應立即報告，嚴密隔離。期待抗MARV 藥物早日上市，造福人類。