轉基因抗蟲、耐除草劑及品質改良復合性狀玉米BBHTL8-1的分子特征及功能評價

鄒俊杰 ，徐妙云 ，張蘭 ，羅彥忠 ，劉源 ，鄭紅艷 ，王磊 *

（1.中國農業科學院生物技術研究所，農業農村部農業基因組學重點實驗室（北京），北京 100081；2.三亞中國農業科學院國家南繁研究院，海南 三亞 572000）

玉米是我國種植面積較大的糧食作物之一，也是重要的飼料及工業原料，在保障國家糧食安全和促進國民經濟發展中發揮重要作用。玉米螟作為重要的鱗翅目類害蟲，每年都對我國的玉米生產造成重大損失［1］。雜草也嚴重危害玉米生產，一般年份減產10%～20%，嚴重年份可達30%～50%以上［2］。利用轉基因技術培育的抗蟲、耐除草劑轉基因玉米成為農業害蟲控制和雜草防除的有效手段，能夠有效減少化學藥劑的施用，降低人工成本，提高玉米產量和品質，對于保護生態環境和生物多樣性具有重要意義。抗蟲和耐除草劑轉基因玉米的研制對于我國玉米產業的發展具有重要意義，轉基因玉米的培育也將是大勢所趨［3］。

自1996年轉基因作物商業化種植以來，轉基因作物的種植面積持續增加。2018年，轉基因作物種植面積達1.91×108hm2，累計種植面積達到25×108hm2，目前已有70個國家/地區應用了轉基因作物。其中，具有復合性狀的轉基因作物種植面積增加了4%，占全球總轉基因作物種植面積的42%［4］。轉基因作物復合性狀以抗蟲耐除草劑、多基因復合抗蟲為主，涉及的作物主要包括棉花、玉米、大豆和油菜［5］。我國也開展了復合性狀轉基因玉米的研究，獲得具有復合抗蟲、耐除草劑性狀的轉基因玉米轉化體［2，6-10］，也獲得兼抗蟲、耐除草劑、耐干旱的轉基因玉米材料［11］。

維生素E（vitamine E，VE）是人類和動物必需的維生素，具有顯著的抗氧化性能［12-13］。飼料中必需添加外源合成的維生素E才能滿足生產的需求，因此提高玉米中的維生素E含量具有良好的營養價值和應用前景。HPT（homogentisate phytyltransferase，尿黑酸植基轉移酶）和TMT（γtocopherol methyltransferase，γ-生育酚甲基轉移酶）是維生素E合成途徑中的關鍵基因，分別控制VE合成的總量及控制低活性VE組分γ-生育酚向高活性VE組分α-生育酚的轉變［14］。已有研究表明，HPT和γ-TMT共表達可以提高總生育酚和α-生育酚含量，單獨表達TMT可以提高α-生育酚含量［15-19］。將玉米ZmTMT在擬南芥和玉米中過量表達，轉基因擬南芥和玉米種子中的α-生育酚含量顯著提高［20］。

為獲得抗蟲、耐除草劑和高維生素E含量的轉基因玉米，在前期研究中將抗鱗翅目和鞘翅目害蟲基因Cry1Ab和Cry3Bb、耐草甘膦基因cp4epsps（農桿菌CP4菌株5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因）、維生素E合成途徑中的ZmHPT和ZmTMT共5個基因構建在一個載體上，通過農桿菌轉化和回交育種，獲得了含有5個外源基因表達框的轉基因玉米材料BBHTL8-1。本研究對BBHTL8-1的分子特征和遺傳穩定性進行了分析，并對轉基因玉米的抗蟲、耐除草劑性能以及籽粒中維生素E含量進行了評價，旨在為培育抗蟲耐除草劑及品質改良的玉米新品系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因玉米材料BBHTL8-1由本課題組創制，BC4F1、BC5F1和BC6F1為BBHTL8-1與玉米優良自交系鄭58（Zheng 58）不同回交世代材料，非轉基因對照材料為回交親本材料鄭58，均由本課題組保存。轉基因田間試驗在河北廊坊中國農科院生物技術研究所試驗基地進行。田間試驗每個小區面積為6 m2（2 m×3 m），行距50 cm，株距20 cm，3次重復，播種后按正常栽培管理。溫室種植條件按照《農業轉基因生物安全評價管理辦法》［21］執行，并已備案（農基安辦報告字〔2018〕第427號，農基安審字〔2019〕第012號）。

1.2 試驗方法

1.2.1 BBHTL8-1材料的獲得將Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT、ZmTMT5個基因構建在一個載體pL8上，載體骨架為pCAMBIA1300，含有5個基因表達框（約18.9 kb），其中Cry1Ab表達框含E35S啟動子，Cry3Bb表達框含OsAct2啟動子，cp4epsps表達框含玉米Ubi啟動子，ZmHPT表達框和ZmTMT表達框均含玉米胚特異表達GLB1啟動子，具體結構如圖1所示。將含有5個基因表達框的載體轉入農桿菌中，利用農桿菌介導的幼胚轉化方法［22］將外源基因導入受體玉米材料Hi-II中，對轉基因陽性植株進行分子鑒定。利用回交轉育的方法將外源片段導入優良自交系鄭58，經過6代回交后再自交篩選，獲得了轉基因玉米材料BBHTL8-1。

圖1 BBHTL8-1外源T-DNA插入片段基因表達框Fig.1 Structure of T-DNA region containing transgenic expression cassettes in BBHTL8-1

1.2.2 BBHTL8-1材料外源插入片段鑒定 取田間生長到3～5葉期的BBHTL8-1和鄭58的葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒（DP302-03，全式金公司）提取玉米基因組DNA。利用高通量全基因組重測序［23］和側翼序列PCR測序方法，確定BBHTL8-1轉基因株系外源T-DNA片段插入位置和兩端基因組序列。根據BBHTL8-1外源基因表達框序列及外源序列插入玉米基因組的位置，設計Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT、ZmTMT特異性擴增引物以及BBHTL8-1外源片段插入基因組特異性檢測引物（表1），由上海生工生物技術有限公司合成。

表1 本研究中應用的引物序列Table 1 Primers used in this study

PCR反應體系：2×TSINGKE Master Mix 10 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，DNA模板 1 μL。PCR擴增條件為：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72℃ 10 min。

1.2.3 BBHTL8-1材料外源插入基因實時熒光定量 PCR（qRT-PCR） 參照SV Total RNA Isolation System（Promega，USA）方法提取玉米BBHTL8-1植株5葉期幼苗的根、莖、葉，以及成熟植株的根、莖、葉和種子的RNA。利用反轉錄試劑盒A3500-Reverse Transcription System（Promega，USA）合成cDNA。采用 SYBR PremixExTaq?（DRR041A，TAKARA）熒光定量試劑盒（引物見表1）檢測外源基因表達量，PCR儀為Applied Biosystems Prism 7500 analyzer。

1.2.4 BBHTL8-1不同組織蛋白表達量測定 采用酶聯免疫分析（ELISA）方法對BBHTL8-1玉米和非轉基因對照玉米地上部整株和籽粒樣本中的Cry1Ab、Cry3Bb、CP4EPSPS、ZmHPT、ZmTMT蛋白的水平進行分析檢測。分別在玉米5葉期、開花期、成熟期取材，包括根、莖、葉、花穗、種子等組織。取植物材料50 mg，用液氮研磨成粉末，加300 μL蛋白提取 buffer溶解蛋白，12 000 r·min—1離心，取上清200 μL，—80 ℃保存；進一步稀釋100倍備用。陰性對照為非轉基因自交系鄭58。分析方法按照EnviroLogix公司試劑盒說明書進行。

ELISA操作步驟如下：分別取50 μL稀釋好的樣品加入96孔酶標板（美國Crystalgen公司）進行反應，3次重復；室溫下孵育30 min；移去上清，用wash buffer洗3～4次；分別加50 μL相應蛋白抗體；室溫下孵育1 h；移去上清，用wash buffer洗3～4次；加100 μL底物，室溫下孵育30 min；加100 μL反應終止液，利用酶標儀（Biotek Synergy H1，美國Bioeck公司）測定OD450吸光值；根據標準曲線分 別 計算 Cry1Ab、Cry3Bb、CP4EPSPS、ZmHPT和ZmTMT蛋白含量。

1.2.5 BBHTL8-1玉米螟抗蟲性鑒定 ①室內玉米螟抗性鑒定。分別選取田間玉米心葉期的心葉、吐絲期的花絲、乳熟期的籽粒，在室內可控條件下鑒定對亞洲玉米螟的抗性。將從田間采回的材料在0.3%NaClO溶液中浸泡3 min消毒，自來水沖洗2遍、蒸餾水沖洗1遍，放在濾紙上將水分吸干。用無菌剪刀將試驗材料剪成約1.5 cm×2.0 cm的小片（段），分別置于培養板中，每孔放適量玉米組織，單頭飼養亞洲玉米螟初孵幼蟲，10孔（飼養10頭幼蟲）作為一個處理，每個處理5次重復，即每個組織測試50頭幼蟲。置于溫度28℃，濕度80%，光照周期16 h光照/8 h黑暗的人工氣候箱內飼養，期間根據各組織被取食消耗情況隨時添加相同來源的新組織。從接蟲第2天開始每2 d調查1次幼蟲存活狀況，記錄存活幼蟲數，調查3次。

②田間玉米螟抗性鑒定。供試材料生長到大喇叭口期開始接種亞洲玉米螟，將玉米螟初孵幼蟲接于心葉中，每株接蟲20～30頭，定期觀察蟲害發生情況。采用國際玉米螟協作組制定的9級分級標準［2］統計危害等級。亞洲玉米螟初孵幼蟲購自中國農業科學院植物保護研究所。

1.2.6 BBHTL8-1田間草甘膦耐受性評價 將轉基因材料及非轉基對照材料各種6行（3次重復），行長4 m，行距為60 cm，株距30 cm。BBHTL8-1及非轉基因對照鄭58生長至5～6葉期時，噴施不同含量的草甘膦，為推薦含量的4倍，對照噴施清水，分別在1周和2周后調查植株死亡率和藥害癥狀。草甘膦為孟山都公司生產的41%草甘膦異丙胺鹽水劑。

1.2.7 BBHTL8-1籽粒生育酚含量測定 采用甲醇/氯仿提取的方法提取生育酚［19］，并用HPLC（high-performance liquid chromatography）檢 測BBHTL8-1和非轉基因對照中不同種類生育酚的含量。檢測方法如下：分別將轉基因玉米種子和非轉基因對照研磨成粉末，稱取100 mg，加入600 μL甲醇氯仿混合液（2∶1），混勻；加入氯仿200 μL，混勻；加入 ddH2O，250 μL，混勻；10 000 r·min—1室溫離心20 min；吸取下層氯仿（各樣品應等體積）至新的EP管，氮氣吹干氯仿；加入100 μL無水乙醇混勻，HPLC測定維生素E含量。利用α-、γ-、δ-生育酚標準品作對照進行質檢。

1.2.8 BBHTL8-1農藝性狀調查 在玉米生長期間調查出苗期、抽雄時期、吐絲期。吐絲后測量株高、穗位高。收獲果穗后考種，測量穗行數、百粒重等農藝性狀指標。

2 結果與分析

2.1 BBHTL8-1轉基因材料的遺傳穩定性分析

為了獲得轉基因抗蟲、耐除草劑及營養品質改良玉米，將抗蟲基因Cry1Ab和Cry3Bb、耐草甘膦基因cp4epsps、維生素E合成途徑中的ZmHPT和ZmTMT構建在一個載體上，包含5個表達框。利用PCR和試紙條對BBHTL8-1株系回交轉育后代進行了連續3代跟蹤檢測，回交株系PCR檢測的陽性植株與陰性植株比例接近1∶1，與單個外源片段插入回交株系理論分離比接近，分離比符合單位點插入的孟德爾遺傳規律。對BBHTL8-1中外源基因進行PCR鑒定，圖2A為BC5F1代中陽性植株PCR結果，表明外源基因在多代回交株系中均能夠穩定遺傳。對BBHTL8-1材料3’端側翼序列進行特異性PCR檢測，擴增片段大小在240 bp左右（圖2B），與理論片段大小相符，對PCR擴增片段進行測序，測序結果能夠分別比對上玉米基因組序列和插入片段序列，表明BBHTL8-1的3’端特異性引物對可以用于BBHTL8-1轉基因株系特異性片段檢測。

圖2 BBHTL8-1外源插入片段PCR鑒定Fig.2 Verification of the transgenic fragments in BBHTL8-1

二代測序技術可以對外源插入片段在轉基因植株中插入位置、插入拷貝數、外源基因的完整性和遺傳穩定性進行分子特征檢測［23］。為了確定BBHTL8-1中外源片段在基因組插入位置，對BBHTL8-1進行高通量全基因組測序和側翼序列PCR測序，與玉米基因組序列B73參考序列RefGen_v4（http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index）進行比對發現，外源基因插入在玉米基因組第4染色體180 575 645～180 577 000之間，外源插入片段位于基因間區，基因組序列有31 bp的丟失。

2.2 BBHTL8-1中外源插入基因相對表達量和蛋白表達量分析

2.2.1 外源插入基因相對表達量分析 BBHTL8-1 材料中含有5個基因表達框，為驗證這5個基因的表達情況，在轉錄水平進行了檢測。qRT-PCR結果（圖3）表明，Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps在5葉期和成熟期的根、莖、葉等組織中表達穩定，在種子中表達量相對較低。ZmHPT和ZmTMT由胚特異性啟動子啟動，因此ZmHPT和ZmTMT在五葉期根、莖、葉中表達量低，而ZmHPT和ZmTMT在成熟期種子中的相對表達量較高。

圖3 BBHTL8-1材料中目標基因在不同時期相對表達量Fig.3 Relative expression levels of target genes in different tissues of BBHTL8-1 lines at different growth stages

2.2.2 蛋白表達量分析 為了檢測外源插入片段中5個基因在BBHTL8-1材料中表達情況，利用酶聯免疫檢測了它們在5葉期、開花期和成熟期不同組織中的蛋白表達量。結果表明，Cry1Ab、Cry3Bb和CP4EPSPS的蛋白水平與轉錄水平類似，在不同生長時期中根、莖、葉及雄穗中均有較高表達，在種子中的表達水平較低。ZmHPT和ZmTMT在5葉期和開花期組織中表達量低，只在種子中有較高表達（圖4）。

圖4 BBHTL8-1材料中在不同時期目標蛋白量Fig.4 Levels of target proteins in different tissues of BBHTL8-1 plants at different growth stages

2.3 BBHTL8-1抗蟲和耐除草劑性能評價

2.3.1 抗玉米螟性能 為了評價BBHTL8-1的抗蟲性能，進行了玉米螟室內生測試驗。取BBHTL8-1的心葉、花絲和籽粒喂食玉米螟，觀察不同時期玉米螟幼蟲死亡率，2 d后玉米螟死亡率在60%左右，喂食6 d后沒有存活的玉米螟，而非轉基因對照喂食玉米螟6 d后的死亡率在5%左右，說明BBHTL8-1對玉米螟有較高抗性（表2）。

表2 室內飼喂BBHTL8-1不同組織玉米螟幼蟲死亡率Table 2 Mortality of corn borer by feeding BBHTL8-1 different tissues

對BBHTL8-1材料進行田間玉米螟抗性評價，在大喇叭口期進行玉米螟接蟲試驗，生長3周后統計蟲害，根據蟲孔大小、梳理及分布情況，對照玉米螟抗蟲分級標準，BBHTL8-1葉片蟲孔針刺狀，稀少且分散，抗性等級為1級，BBHTL8-1為高抗玉米螟材料（圖5）。

圖5 抗玉米螟性能評價Fig.5 Evaluation of Asian corn borer resistance

2.3.2 耐除草劑性能 BBHTL8-1中含有CP4EPSPS蛋白，能夠使玉米具有抗草甘膦的特性，對BBHTL8-1抗除草劑性能進行評價，按照正常噴施濃度的4倍進行噴施，在1周和2周后調查死亡率。未噴施除草劑對照組，BBHTL8-1和對照鄭58長勢一致。噴施草甘膦BBHTL8-1生長不受影響，與未噴施長勢一致，而對照鄭58則全部死亡，說明BBHTL8-1具有很好的草甘膦抗性（圖6）。

圖6 抗蟲耐除草劑性能評價Fig.6 Evaluation of herbicide tolerance

2.4 BBHTL8-1維生素E組分含量評價

利用胚特異啟動子在BBHTL8-1玉米籽粒中過量表達ZmHPT和ZmTMT，對 BBHTL8-1和非轉基因對照鄭58成熟籽粒不同世代中不同種類生育酚含量進行了檢測，結果表明，鄭58籽粒中維生素E的組分以γ-生育酚的含量為最高，而轉基因植株籽粒中以α-生育酚的含量最高。說明ZmTMT在玉米體內能正常發揮其功能，將低活性的γ-生育酚轉為了高活性的α-生育酚。另外，BBHTL8-1籽粒中總生育酚含量也較鄭58對照提高約20%（表3）。

表3 BBHTL8-1籽粒中維生素E組分含量Table 3 Content of VE composition of maize seeds in BBHTL8-1 and Zheng 58 （mg·100 g—1）

2.5 BBHTL8-1農藝性狀評價

為了研究BBHTL8-1中外源片段5個基因的插入是否會影響玉米農藝性狀，將BBHTL8-1與鄭58的生育周期、抽雄期、株高、穗位高、穗行數、百粒重、萌發率等農藝性狀進行了觀察和比較，結果（表4）表明：在正常栽培條件下，轉基因BBHTL8-1植株與對照鄭58在生育周期、抽雄期、株高、穗位高、穗行數、百粒重、萌發率方面無顯著差別，適應性與對照鄭58相當。在田間農業生產過程中，因BBHTL8-1具有耐除草劑性能，同時含有抗鱗翅目和鞘翅目害蟲基因，在玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲、雙斑螢葉甲等蟲害嚴重時，其生長性能可能要優于對照鄭58。

表4 BBHTL8-1與鄭58農藝性狀比較Table 4 Comparison of agronomic trais between BBHTL8-1 and Zheng 58

3 討論

與單性狀抗蟲或耐除草劑轉基因作物相比，復合性狀轉基因作物能夠將多個性狀聚集在一個作物，不僅能滿足農業發展需求，同時也開辟了新的育種途徑［24］。復合性狀轉基因作物的種植面積呈現逐年增加的趨勢。2018年，復合性狀的轉基因作物種植面積占總面積的42%［4］。轉基因作物的復合性狀主要以抗蟲耐除草劑、多基因復合抗蟲為主，涉及的作物包括棉花、玉米、大豆和油菜。由陶氏益農和孟山都公司合作研制的Smartstax?轉基因玉米含有8個新基因，具有抗地上害蟲和地下害蟲以及抗除草劑3種性狀［5］。我國自2008年啟動轉基因生物新品種培育重大專項以來，已培育了眾多具有自主知識產權的抗蟲耐除草劑復合性狀轉基因玉米優良轉化體［3］。本研究獲得的BBHTL8-1株系，Cry1Ab和Cry3Bb蛋白分別抗鱗翅目和鞘翅目害蟲，CP4EPSPS耐受草甘膦除草劑，ZmHPT和ZmTMT能夠提高籽粒中維生素E組分的含量及有活性的α-生育酚含量。因此，BBHTL8-1是具有多基因抗蟲、耐除草劑及品質改良復合性狀的轉基因玉米株系，將具有廣闊的應用前景。

復合性狀獲得一般通過3個途徑，共轉化、再轉化以及雜交育種復合［25］。共轉化已被證明是迄今為止在植物中引入多種基因的最有前途的方法之一，主要優點就是共同導入的外源基因整合在染色體同一位置，確保聚合的不同基因不會在后代分離［26］。目前大多數具有復合性狀的轉基因作物都是利用傳統的育種手段獲得的，復合性狀對于T-DNA的遺傳穩定性沒有影響［25］。除了抗蟲耐除草劑外，復合抗病性狀的基因賦予轉基因作物有效抵抗病蟲害及雜草的能力［27］。本研究中通過將5個基因表達框聚合在同一載體上，并利用農桿菌侵染玉米幼胚篩選獲得了BBHTL8-1株系，這5個基因在專輯株系中能穩定遺傳，在轉錄水平和蛋白水平表達方面具有穩定性（圖1～3）。隨著生物技術的發展，聚合更多基因成為可能，利用GAANTRY stacking系統可以將含有10個25.8 kb的T-DNA片段導入植物體，并可以聚合更多的基因，獲得具有多個復合性狀的轉基因植物［26］。

本研究中獲得的BBHTL8-1與非轉基因對照在農藝性狀上沒有明顯差異。進一步的研究將對BBHTL8-1的分子特征、環境安全和食品安全等方面進行環境釋放階段的安全評價，為BBHTL8-1下一階段的轉基因安全評價申報奠定基礎，加快轉基因抗蟲耐除草劑及品質改良玉米新品系的培育。