魚類干細胞育種技術回顧與展望

張彎彎，易梅生

（中山大學海洋科學學院，廣東 珠海 519082）

魚類作為人類優質動物蛋白的重要來源，在滿足不斷增長的食物和營養需求方面占重要地位，其中海水魚類因富含長鏈多不飽和脂肪酸、維生素和微量元素，對人類健康尤為重要［1］。然而，目前能進行規模化養殖的魚類品種非常有限，并且在長期的養殖中面臨著種質退化等問題。因此，運用現代生物技術創制新種質、培育優質品種是魚類養殖業的迫切需求。

品種改良是促進水產養殖業發展的主要手段之一。傳統魚類品種改良的方法主要為選擇育種、雜交育種、染色體組操作及性控育種等。近年來，分子標記、全基因組選擇、轉基因及基因編輯和細胞工程等現代生物育種技術發展迅速［2］。選擇育種是指對具有優良性狀的個體進行選擇和培育，并輔以功能基因相關的分子標記進行選擇［3］，但經多代選擇后近交衰退現象明顯，嚴重影響育種效率。雜交育種是育種的另一重要方法，20世紀50年代開始在魚類中廣泛應用，通過種間雜交培育了眾多養殖新品系［4-5］，但魚類雜交育種仍存在工作量大、周期長等局限［6］。基因編輯技術為魚類育種提供了新的技術手段，已應用于多種魚類品系的培育，包括虹鱒、草魚、鯉魚、尼羅羅非魚和金頭鯛等［7］，具有廣闊的發展前景。

細胞工程育種是在細胞或染色體組水平上進行遺傳改良的育種技術［8］，主要包括多倍體育種、細胞核移植、干細胞和單性生殖等。其中，多倍體育種和單性生殖在魚類育種中取得了令人矚目的成就［3-4，9］。近年來，干細胞技術快速發展，本文主要對魚類干細胞誘導和移植技術的研究進展及其在育種中的應用進行綜述，總結魚類干細胞育種技術面臨的問題，并對其發展前景進行展望，旨在為魚類育種技術研究提供參考。

1 魚類干細胞

干細胞是在一定條件下具有無限自我更新和發育潛能的一類細胞，根據其來源可分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞（adult stem cell，ASC）。自小鼠ESC培養成功以來［10-11］，哺乳動物干細胞在基礎和應用研究方面都取得了一系列重大成就。比較而言，低等脊椎動物干細胞研究起步較晚，始于模式動物斑馬魚和日本青鳉 ESC 的培養［12-13］。自 Hong等［14］在青鳉中建立無滋養干細胞培養體系后，干細胞培養技術在多種魚類中獲得成功［15-16］，這些工作為魚類干細胞的深入研究奠定了基礎。先后建立的半克隆（semi-cloning）、移植及誘導等干細胞操作技術［16-17］顯示出干細胞在魚類克隆和良種培育等方面具有重要的應用價值。

2 魚類干細胞移植及應用

2.1 胚胎干細胞移植

胚胎干細胞具有發育多能性，一定條件下，在體內、體外均可分化為包括生殖細胞在內的多種細胞類型。細胞移植是誘導干細胞體內分化研究的常用方法。在魚類中，Wakamatsu等［18］使用青鳉囊胚細胞建立了魚類細胞移植形成嵌合體的方法。隨后Hong等［19］將長期培養的青鳉ESC移植到囊胚，發現供體細胞能參與受體胚胎多種組織器官的分化，但未能像小鼠ESC那樣實現供體細胞的生殖系傳遞。盡管Ma等［20］使用短期培養的斑馬魚胚胎細胞成功獲得生殖系嵌合體，但魚類長期培養ESC的有效生殖系傳遞仍然存在技術瓶頸。

細胞核移植是獲得供體細胞來源后代個體的另一方法，即將供體細胞核通過顯微操作方法移植到同種或異種動物的成熟卵子中以獲得后代個體。早在20世紀60年代，童第周等［21］開創了魚類核移植研究先河，在金魚和鳑魚中證明了魚類細胞核移植的可行性。1980年，中國科學家以鯉魚細胞核和鯽魚細胞質配合培育出核質雜種魚，成為世界上第1條克隆魚，也是第1例可發育成熟的異種間胚胎細胞克隆動物［22］。1986年，我國首次報道體細胞克隆動物的形成，證實成年鯽魚的體細胞可以去分化和再程序化，具有發育成個體的全能性［23］。此后，核移植技術廣泛應用于核質雜種克隆魚研究，為魚類核質關系研究和魚類品種改良的發展作出了重要貢獻［24］。魚類細胞核移植技術多用于未培養細胞或短期培養細胞。對于長期培養細胞的核移植尚有局限性，特別是隨著魚類基因組編輯技術的發展，長期培養細胞的核移植研究更有意義。Lee等［25］將培養12～26周的斑馬魚細胞的細胞核移植到去核卵母細胞中，得到可成活的二倍體后代。Yi等［17］在青鳉中成功培養了單倍體ESC，并將穩定表達熒光標記的細胞核植入成熟卵母細胞中，獲得首例可育半克隆（semicloned）魚Holly，其二倍基因組來源于2個不同個體，類似于有性生殖產生的后代。因此，ESC培養，特別是單倍體ESC培養，結合核移植及基因組編輯等技術是魚類優良種質創制的重要途徑。

2.2 原始生殖細胞移植

魚類原始生殖細胞（primordial germ cell，PGC）是雌雄配子的前體細胞。脊椎動物PGC移植產生供體細胞來源后代的實驗最初在雞中獲得成功［26］。在魚類中，Lin等［27］將斑馬魚中囊胚卵裂球植入同一發育階段的受體胚胎中，獲得供體細胞來源的后代，表明供體細胞（含PGC和體細胞）成功嵌入受體生殖系并分化為功能配子。Takeuchi等［28］用從養殖魚類虹鱒早期性腺中分離的PGC進行移植得到了類似結果。種內PGC移植在泥鰍中也有嘗試，其PGC移植后產生生殖系嵌合體，嵌合率達25%，且能夠產生移植后代個體［29］。在種間移植中，Yamaha等［30］將二倍體金魚PGC和體細胞的混合細胞移植到三倍體鯽魚中，成功從嵌合體中獲得了金魚配子。在種間單個PGC移植中，不同屬（金魚移植到斑馬魚）和不同科（泥鰍移植到斑馬魚）間形成的嵌合體也可以產生供體細胞來源的配子［31］。但在不同目或親緣關系更遠的物種間，如日本鰻（Anguillajaponica）到斑馬魚［32］、鱘（genusAcipenser）到金魚［33］之間，雖能以較低成功率形成生殖嵌合體，卻不能產生供體細胞配子。因此，在魚類中，無論是種內還是種間，通過PGC移植獲得供體細胞物種來源的配子切實可行，但由于魚類胚胎中PGC數量有限，該方法的廣泛使用，特別是在養殖魚類中的使用存在一定局限。

2.3 生殖干細胞移植

原始生殖細胞經過有絲分裂形成精原細胞（spermatogonia）或卵原細胞（oogonia）。作為生殖干細胞，精原細胞也可以作為細胞移植技術的供體細胞。將小鼠供體精原細胞移植到不育小鼠的性腺中，可產生具有供體遺傳特征的可育精子［34］。精原細胞由于數量多，且易于分離和純化，已成為生殖干細胞移植的主要細胞類型。在魚類中，將包含精原干細胞（spermatogonial stem cell，SSC）的虹鱒精巢細胞分別移植到剛孵化的雌性和雄性胚胎中，雌雄嵌合體可分別形成源于供體細胞的成熟精子和卵細胞，表明SSC在受體胚胎中具有類似PGC的分化能力，并且其分化的配子類型取決于受體胚胎的性別表型［35］。在種間移植中，Okutsu等［36］將虹鱒的精巢細胞移植入馬蘇鮭魚（Oncorhynchusmasou）中，性成熟嵌合體成功產生虹鱒功能配子。這些研究表明，無論種間還是種內，移植的精原細胞均可產生可育配子。隨后，精原細胞移植研究在多種淡水和海水魚類中展開，在種內和種間移植的嵌合體中均得到成熟精子或卵子，包括鯉［37］、青鳉［38］和紅鰭東方鲀（Takifugurubripes）［39］等模式和經濟魚類。在種間移植中，隨著供體與受體種類間的系統發育距離增大，特別是不同科或目間，生殖細胞的移植成功率大大降低。但在淡水魚中，精原細胞移植技術仍然可以在不同種和不同目間移植，例如泥鰍和斑馬魚（科間）［37］、克林雷氏鯰（Rhamdiaquelen）和尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）（目間）［40］等。海水魚類由于繁殖周期長、生長環境復雜，精原細胞的移植僅局限于科間，且移植的生殖細胞往往在受體內難以分化為成熟的功能性配子［41］。最近，鲆類科間的精原細胞移植取得重要進展，中國科學院海洋研究所劉清華等將牙鲆、夏牙鲆和大菱鲆的冷凍精原細胞移植到三倍體牙鲆幼魚體內，分別獲得了100%、75%～95%和33%～50%的供體細胞嵌合率，并能夠產生源于供體細胞的精子，成功繁育后代（未發表資料）。除精原細胞外，魚類卵原細胞也可用于移植，Yoshizaki等［42］報道，分離自6～9月齡虹鱒幼魚的卵原細胞在2種性別的受體中都表現出良好的分化可塑性，在雌雄受體中分別分化為成熟卵子和精子，產生正常后代個體。

綜上，生殖干細胞移植在魚類育種中表現出育種時間短、效率高的顯著優勢，但該技術操作難度大、技術體系尚未完全成熟以及在不同魚類中應用的共性問題等需要進一步完善。

2.4 生殖干細胞移植操作過程及影響因素

生殖干細胞移植是近年發展起來并逐步完善的一項魚類生殖操作新技術，其過程大致可歸納為3個主要步驟：①供體細胞分離、純化和鑒定；②受體準備；③細胞移植。提高細胞移植成功率的關鍵在于供體細胞時期的選擇和移植受體的制備。

生殖干細胞可從幼魚或成魚性腺中通過機械和酶解等方法分離。常用的細胞純化方法包括密度梯度離心和流式分選等，密度梯度離心的介質包括Percoll、Ficoll和BSA等［43］；流式分選法多用于模式魚類，通過表達熒光標記的生殖細胞標記基因（如vasa）啟動子，借助流式細胞技術可有效分選熒光蛋白陽性細胞，從而達到純化精原細胞的目的［44］。在經濟魚類中，可用生殖細胞表面蛋白，如虹鱒Ly75蛋白［45］和羅非魚Gfra1受體［46］等作為精原細胞的細胞表面標記。

生殖干細胞移植受體可以是胚胎、幼魚或成魚。除受體與供體親緣關系和繁殖周期等對生殖干細胞移植的成功率有顯著影響外，受體育性也是影響生殖系嵌合體形成的重要因素。移植操作中，合適發育時期的胚胎受體可以直接用于移植，若在移植前去除或減少受體胚胎生殖細胞，則可顯著提高移植成功率。目前，生殖細胞去除方法有化學處理、物理處理、遺傳操作或組合處理。白消安（busulfan）可通過影響旺盛分裂的細胞去除性腺中的生殖細胞。Lacerda等［47］使用白消安結合熱處理羅非魚成魚約12周，成功去除精巢中的生殖細胞。染色體組操作是另一種產生不育移植受體的方法，通過二倍體和四倍體個體雜交，或者在受精后對卵子用靜水壓和熱休克等方法處理可產生三倍體不育個體［2］。使用三倍體作為生殖干細胞移植受體在種內和種間移植都有成功的報道［39］。另外，通過基因編輯技術敲除或敲降生殖細胞發育關鍵基因（如deadend）抑制生殖細胞形成也是消除移植受體生殖細胞的有效方法［48］。

3 魚類干細胞體外誘導和分化

3.1 胚胎干細胞誘導

ESC具有分化多能性，在體內和體外可分化為各種細胞類型。小鼠ESC可在體外誘導成PGC，并分化為具有功能的精子和卵子［49］。在魚類中盡管也建立了多種海、淡水魚的ESC細胞系，但尚沒有ESC體外分化成生殖細胞的報道，因此，這是魚類ESC研究中亟需突破的技術瓶頸。

3.2 生殖干細胞培養和誘導分化

存在于性腺中的生殖干細胞維持著生物體生命周期中配子的發生和世代間遺傳信息的傳遞。同ESC一樣，生殖干細胞在合適的條件下可以進行增殖和分化。但相較于ESC，SSC培養技術發展較慢，主要由于SSC在體外培養中難以成為長期穩定生長的細胞系。Hong等［16］首次使用青鳉成魚精巢建立精原干細胞系SG3，SG3細胞能夠在體外培養中長期穩定生長，在適當誘導條件下可進入減數分裂并產生活動精子。

雖然魚類長期穩定生長的SSC細胞系數量有限，且缺乏分化為功能配子的能力，但通過誘導短期培養SSC體外分化是配子形成的另一可行途徑。Miura等［50］將日本鰻的精原細胞進行誘導，在精巢培養體系中用11-酮基睪酮誘導成熟精巢中的A型和早期B型精原細胞進入減數分裂，形成精子。采用類似的誘導策略，精子體外誘導在羅非魚［51］和青鳉［52］中也得以成功實現。這些體外誘導的精子不論是否具有受精能力都表明誘導魚類SSC分化為精子是可行的。2002年，Sakai等［53］在以Sertoli細胞作為飼養層的培養體系中，將從斑馬魚精巢中分離的精原細胞誘導分化為功能精子，并通過人工受精獲得正常胚胎。隨著近年來體外誘導系統的優化，目前已在多種經濟魚類中實現了可育精子的誘導，如胡子鯰［54］、南亞野鯪［55］和虹鱒［56］等。魚類體外精子誘導體系的建立和優化，為縮短魚類育種周期提供了技術支撐。

3.3 影響生殖干細胞誘導效率的因素

魚類生殖干細胞體外成功誘導主要取決于2個關鍵因素：細胞因子和培養微環境。細胞因子可以顯著促進和提高精原細胞的誘導效率。在鰻魚精原細胞體外分化中，11-酮基睪酮的誘導作用至關重要［50］。內皮細胞生長因子是另一類SSC分化促進因子，Lif、Fgf2和Gdnf等能夠顯著提高斑馬魚生殖細胞存活率和維持生殖細胞特性［57］。研究表明，胰島素樣生長因子和人絨毛膜促性腺激素也有促進精原細胞增殖的作用［51］。隨著研究的不斷開展，將有更多更有效的細胞因子被發現。

生殖干細胞的體外分化依賴于特定的微環境。在斑馬魚精原細胞分化中，源于精巢的飼養細胞腫瘤樣細胞ZtA6或Sertoli細胞通過表達sox9a等因子來維持細胞分化的微環境［53］。此外，培養誘導體系的空間結構也影響細胞分化效率，在培養系統中模擬體內精巢的囊性結構可顯著提高精子的形成效率。Higaki等［58］研究了瀕危魚類暗斑頜須（Gnathopogoncaerulescens）精原細胞的體外分化，發現3D培養體系的誘導效率顯著高于2D體系。目前，有各種商業化3D培養系統可用于細胞培養。近期，本課題組以3D trans-well（BD）為基礎支架建立3D細胞培養體系，誘導海水魚中華烏塘鱧生殖干細胞分化，取得了良好效果，誘導30 d后可產生大量可育精子，并能以較高效率授精卵母細胞。將該誘導系統用于淡水魚斑鱧和草魚，同樣成功誘導出有運動能力的精子（未發表資料）。

4 展望

魚類主要通過有性生殖繁衍后代。受精卵經胚胎發育形成個體，個體生長到一定階段達到性成熟，產生生殖細胞，繁育后代。不同種類的魚繁殖周期存在較大差異，通常從一年到幾年甚至十幾年。經濟魚類的繁殖周期一般較長，無論是通過選育法還是雜交法，新品種的培育往往需要花費很長時間。生殖干細胞移植和誘導等生殖細胞操作技術能大大縮短配子形成時間，加快育種進程，同時也便于基因操作，因此在經濟魚類育種中具有較高的應用價值。然而，生殖細胞操作技術研究雖然在近年來取得了較大進展，但有一些關鍵問題亟待解決。①無論是生殖干細胞體外誘導還是移植嵌合體體內分化，其效率均偏低。如何針對特定種類，提高功能配子的產生效率，仍然存在技術挑戰。②魚類種類繁多，其生殖和生理特性多種多樣。在生殖細胞移植中，不同目、科、屬和種的魚類間存在細胞排異現象，使供體細胞和受體魚種類的選擇受到限制。如能突破親緣關系的局限，即可擴大受體選擇范圍，特別是選擇繁育周期短的魚類作為受體則可顯著提高移植成功率。③生殖細胞誘導和移植技術目前只在為數不多的魚類中取得成功，尤其是在大宗養殖魚類中的研究較少；同時，用于每種魚類的移植和誘導體系各有差異，而同一體系用于不同魚類所產生的效果也差別較大。如用于中華烏塘鱧的3D誘導體系，應用于斑鱧時可較高效率地產生精子，但用于草魚時則產生較多形態不正常的精子。因此生殖細胞操作應用于各種魚類的技術共性還有待突破。這需要在更多更有代表性的魚類中廣泛開展研究，積累總結共性技術的基礎資料和經驗。④生殖細胞操作與其他現代育種技術結合不夠緊密。基因編輯技術育種和分子標記輔助育種等是現代魚類育種的發展趨勢［2］，生殖細胞操作技術研究應加強與這些育種方法的結合。同時，干細胞培養和體外誘導技術的發展也為基因編輯技術用于魚類新種質的快速創制創造了條件。總之，在魚類干細胞育種技術研究中，應著重解決這些問題。隨著魚類干細胞操作技術的發展，將其與基因和基因組操作技術相結合，通過創制優質“試管配子”以培養魚類新品種將成為重要育種方法，極大地促進養殖魚類種業的發展。