不同施氮量下黑果枸杞對干旱脅迫的響應

馬興東，郭曄紅*，李梅英，于霞霞，徐英杰，朱文娟，馮潔

（1.甘肅農業大學農學院，中藥材研究所，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，蘭州 730070；2.國家林業和草原局甘肅瀕危動物保護中心，甘肅 武威 733000；3.吐魯番職業技術學院，新疆 吐魯番 838000）

干旱脅迫嚴重制約著植物的生長發育，在我國西北干旱地區植物受干旱脅迫的影響極其明顯。干旱可使植物根、莖、葉等器官發生萎蔫，從而降低植株水分代謝、氧分代謝、生理激素含量、滲透調節能力和光合作用等［1-2］，嚴重時還會造成減產甚至植株死亡［3］。因此，植物對干旱脅迫的耐受性及抗旱機理研究受到學者們的廣泛關注，在小麥［4-6］、玉米［7］和棉花［8］等重要作物中進行了大量研究。植物抗旱性主要是由體內含水量、抗氧化自由基、膜脂過氧化產物和滲透調節物質等因素共同作用的結果［9-10］。干旱脅迫下，植物體內的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸（proline，Pro）和可溶性糖（soluble sugar，SS）含量都會發生變化。鄭世英等［11］研究發現，干旱脅迫下小麥中SOD活性呈先升高后降低的趨勢；顧建勤等［12］研究發現，干旱脅迫使豌豆葉片中POD與CAT活性升高；季楊等［13］研究發現，干旱脅迫導致植物體內膜脂過氧化水平升高，造成MDA含量增加，使植物生長受損；于霞霞等［10］研究發現，干旱脅迫使肉蓯蓉寄主植物梭梭葉片中Pro含量增加；趙振寧等［14］研究發現，干旱脅迫使大豆中SS含量增加。上述研究均表明，植物的抗旱性與SOD、POD、CAT、MDA、Pro和SS等生理指標密切相關。

氮（N）作為植物生長發育的關鍵營養元素，對植株的生長、光合作用和產量積累等都有一定的促進作用［15］。研究表明，施氮能提高植物的抗旱性，其作用機理也是通過提高抗氧化酶活性和膜脂過氧化產物及滲透調節物含量，從而提高植物的抗旱性［16-17］。黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.）為多年生、喜陽喜旱灌木，在抗旱、抗鹽堿、水土保持方面有一定的價值，其果實又叫黑枸杞，有著很高的營養價值［18-19］。干旱脅迫對黑果枸杞生長發育有一定影響，宗莉等［20］研究表明，干旱脅迫制約著黑果枸杞種子的萌發；李永潔等［21］發現，干旱脅迫對黑果枸杞植株的生長、生物量積累和抗氧化酶活性都有一定的影響；郭有燕等［22］研究表明，干旱脅迫會抑制黑果枸杞的光合作用。由此可見，干旱脅迫對黑果枸杞的生長極為不利，提高其抗旱能力是黑果枸杞種植過程中亟待解決的問題。趙晶忠等［23］研究認為，低溫層積處理可以適當緩解黑果枸杞受干旱脅迫的影響程度，提高出苗率；可靜等［24］研究認為，噴施外源水楊酸可以提高黑果枸杞植株內抗氧化酶活性，降低MDA含量，從而提高其抗旱能力。但是，關于施氮量對黑果枸杞干旱脅迫響應的影響，目前尚未見研究報道。因此本實驗室歷時2年，研究不同氮肥施用量下，黑果枸杞對不同干旱脅迫的響應，旨在探明施氮對黑果枸杞抗旱生理的影響，以期為干旱區黑果枸杞的栽培模式提供參考依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在甘肅省武威市國家林草局甘肅瀕危動物保護中心（38°05′N，102°43′E，海拔1 632 m）進行。該區日照強烈，降水稀少且蒸發量大，2018和2019年的降水量分別為155和127 mm，近10年（2009—2018）的年平均降水量140 mm，為典型的干旱區；0—20 cm土壤全氮含量0.51 g·kg-1、速效氮含量0.027 g·kg-1，耕作模式主要為旱作農業。

1.2 試驗設計

試驗材料為青海諾木洪農場購置的2年黑果枸杞，于2017年秋進行整地、起壟，壟高30 cm，并施有機肥作基肥，2018年春移栽枸杞苗至試驗地，栽培株行距3 m×2 m，每小區種植5株，小區面積30 m2。分別在2018和2019年設置0（CK）、50（N1）、100（N2）、150（N3）和 200 g·株-1（N4）共5個施氮量處理，氮源為尿素（含氮量46%，青海中航資源有限公司），分3次按照4∶3∶3的比例于每年的4月20日、6月10日和7月1日施入，施肥方式為穴施，穴深30 cm，距離主桿30 cm。每個處理3次重復，共15個小區，試驗區總面積450 m2。前兩次施肥后適量灌溉以便肥料溶解，最后一次氮肥施用后進行充分灌溉，灌水高至壟面后停止供水，試驗期內不再灌水。于1周后土壤水分含量至黑果枸杞正常需水時記為干旱脅迫第0天，隨后至干旱脅迫第15和30天時進行土壤相對含水量和葉片生理指標的測定。

1.3 指標的測定

分別于干旱持續脅迫0、15和30 d時，用多點取樣法采取0—30 cm的土樣，采用105℃烘干飽和稱重法測定的土壤相對含水量分別為30.8%、21.7%、11.2%（2018）和 29.3%、21.1%、9.7%（2019）。

選取大小相近、色澤相似的成熟健康全葉測定生理指標。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑還原法；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用鉬酸銨比色法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法；脯氨酸（Pro）含量測定采用酸性茚三酮法；可溶性糖（SS）含量的測定采用蒽酮比色法。以上操作均用UV-2450紫外-可見分光光度計測定吸光值［25］。

1.4 抗旱性的評價

采用隸屬函數法對6個抗旱指標進行綜合評價，計算公式如下。

式中，X為各指標的測定值，Xmax、Xmin分別為指標測定的最大與最小值，若該指標與抗旱性呈正相關，則用式（1）計算，若該指標與抗旱性呈負相關，則用式（2）計算，將所求數值取平均值，其值越大則表示抗旱性越強。

1.5 數據處理

利用Excel 2010軟件進行數據處理及作圖，利用SPSS 22.0軟件進行隸屬函數分析。

2 結果分析

2.1 不同施氮量對抗氧化酶活性的影響

不同干旱脅迫下，不同施氮量對黑果枸杞葉片中抗氧化酶活性的影響見圖1，結果表明，施氮量對黑果枸杞葉片中抗氧化物酶的活性有顯著影響。隨著施氮量的增加，3種酶活性均呈上升趨勢，其中，SOD活性在干旱脅迫0 d時N4處理最高，分別較CK顯著提高23.2%（2018）和76.8%（2019）；在干旱脅迫15 d時仍然是N4處理的SOD活性最高，分別較CK提高29.3%（2018）與54.8%（2019）；在干旱脅迫30 d時，2018年N3處理的SOD活性最高，較CK顯著提高22.9%，2019年N4處理的SOD活性最高，較CK顯著提高53.6%。POD活性在干旱脅迫0 d時N3處理最高，分別較CK顯著提高48.3%（2018）與23.8%（2019）；在干旱脅迫15和30 d時N4處理的POD活性最高，分別較CK顯著提高33.2%、50.3%（2018）和23.2%、16.4%（2019）。CAT活性在干旱脅迫0和15 d時N4處理最高，較CK顯著提高27.7%、13.3%（2018）和 27.0%、22.9%（2019）；干旱脅迫 30 d時，2018年N4處理的CAT活性最高，較CK提高40.8%，2019年N3處理的CAT活性最高，較CK顯著提高61.3%。

圖1 不同施氮量下黑果枸杞葉片中SOD、POD和CAT活性Fig.1 Activities of SOD，POD and CAT in leaf of Lycium ruthenicum Murr under different N applications

2.2 不同施氮量對MDA含量的影響

施氮量對黑果枸杞葉片中MDA含量有顯著影響，隨著施氮量的增加，其含量均呈先降后升的趨勢（圖2）。2018年在干旱脅迫0 d時，N3處理的MDA含量最低，較CK顯著降低37.5%；在干旱脅迫15和30 d時，N2處理葉片MDA含量最低，分別較CK降29.5%和28.3%。2019年在干旱脅迫0和30 d時，N2處理的MDA含量最低，分別較CK降低25.7%和8.2%；在干旱脅迫15 d時，N3處理的MDA含量最低，較CK降低51.1%。

圖2 不同施氮量下黑果枸杞葉片MDA含量Fig.2 MDA contents in leaf of Lycium ruthenicum Murr under different N applications

2.3 不同施氮量對滲透調節物的影響

施氮量對黑果枸杞葉片Pro含量無顯著影響，但對SS含量影響較大（圖3）。2018年，在干旱脅迫0和30 d時，施氮處理的Pro含量均較CK顯著增加，但不同施氮時量處理間無顯著差異；2019年，在干旱脅迫0和15 d時，施氮處理的Pro含量顯著高于CK，但不同施氮量處理間無顯著差異；各處理在2018年干旱脅迫15 d和2019年干旱脅迫30 d均無顯著差異。SS含量隨施氮量的增加呈上升趨勢。其中，N3和N4處理的SS量各個時期均顯著高于其他處理，但兩者間差異不顯著。

圖3 不同施氮量下黑果枸杞葉片Pro和SS含量Fig.3 Content of Pro and SS in leaf of Lycium ruthenicum Murr under different N applications

2.4 黑果枸杞綜合抗旱性對施氮量的響應

對SOD、POD、CAT、MDA、Pro和SS 6個指標進行綜合評價分析，結果表明（表1），干旱脅迫0 d，黑果枸杞在不同施氮量下的抗旱性依次為：N2＞N1＞CK＞N3＞N4 （2018） 和 N3＞N2＞N1＞N4＞CK（2019）；干旱脅迫15 d，不同施氮處理的抗旱性依次為：N2＞N1＞N3＞N4＞CK（2018）和 N3＞N2＞N4＞CK＞N1（2019）；干旱脅迫30 d，黑果枸杞在不同施氮量下的抗旱性均為：N2＞N3＞N1＞CK＞N4。綜上可知，干旱脅迫0和15 d，N2與N3處理的抗旱性最強；干旱脅迫30 d，N2處理的抗旱性最強，因此，施氮100～150 g·株-1時有利于提高黑果枸杞的抗旱性。

表1 不同施氮量下黑果枸杞綜合生理指標的平均隸屬函數值Table 1 Average subordinate function values of different N application rates for Lycium ruthenicum Murr.

續表Continued

3 討論

SOD、POD和CAT等被認為是植物中有毒物質的清除劑［26］。SOD可以清除植物在外界脅迫環境下產生的超氧陰離子自由基［27］；POD作為一種重要的保護酶，被廣泛用于衡量植物在外界脅迫環境因子下受傷害嚴重程度的一個重要指標，它和CAT有清除植物體內活性氧自由基的作用，在遭遇環境脅迫時保護植物體自身免受或少受傷害，通過其活性的提高來增強植物對外界環境的耐受能力［28］。本研究中，隨著施氮量的增加，黑果枸杞葉片中SOD、POD和CAT活性均呈上升趨勢，表明施氮有利于提升植物體內保護酶的活性，從而增強植物體對外界逆境脅迫的抵御能力，對自身的生長發育起到保護作用，這與李建榮［29］的研究結果相一致。本研究還發現，過量施氮會使SOD、POD和CAT活性降低。根據Fridorich［30］提出的生物自由基傷害學說推測，過量施氮可能會對植物機體產生一定程度的影響，活性S氧（reactive oxygen species，ROS）清除等抵御系統的調控能力可能會逐漸減弱，從而影響抗氧化酶的活性。

MDA作為細胞膜脂過氧化的最終產物，是衡量膜脂過氧化程度的指標，其含量反映了植物細胞膜透性的強弱和質膜受損傷的程度。MDA含量的變化也可反應外界條件下植物受脅迫的程度，含量越高說明細胞膜脂質過氧化作用越強，細胞膜受破壞程度越大［31］。本研究中，隨著施氮量的增加，黑果枸杞葉片中MDA含量逐漸減少，表明適量的施氮可抑制MDA合成，對植株正常生長起一定的保護作用，這與李娜［32］的研究結果基本一致，此時膜脂通透性增強，對質膜起到保護作用，進而降低了植物受外界脅迫的損害程度；但隨著施氮量的持續增加，MDA含量又明顯升高，表明過量施氮可能會造成細胞膜脂的損傷。滲透調節是植物抵御干旱脅迫的一種適應機制，植物通過滲透調節使細胞內膨壓維持正常，以保證細胞內各種生理過程的正常進行［33-34］。Pro和SS是植物在干旱脅迫時主要的滲透調節物質，在生長環境遭遇干旱脅迫時，通過維持滲透平衡來緩沖環境對植物的傷害以維持正常代謝［35］。本研究表明，在一定范圍內增加施氮量，黑果枸杞葉片中Pro和SS含量有增加趨勢，表明氮肥對Pro和SS的合成有一定的促進作用，與李永潔等［21］和Kuhns等［36］的研究結果一致。

植物的抗旱性是多種因素綜合作用的結果，因此，單一的指標很難準確地描述其抗旱性。本研究綜合多個指標，運用隸屬函數法對黑果枸杞的抗旱性進行綜合評價表明，適量施氮可以增強黑果枸杞的抗旱性，施氮過量則可能會影響其抗旱能力。在不同天數的干旱脅迫下，隨著施氮量的適當增加，黑果枸杞的抗旱性逐漸提高；當超過一定施氮量后，其抗旱性也隨之降低。在2018—2019年，不同干旱脅迫下黑果枸杞在N2或N3處理時表現出較強的抗旱性，說明施氮有利于提高黑果枸杞的抗旱能力，與王曦等［37］的研究結果相一致。但研究也發現，過量施氮可能會對植株造成一定的脅迫，因此過量施氮會影響黑果枸杞的生長及抗旱性。