遮陰對烤煙煙堿合成調控的影響

羅俊，周宏，錢發(fā)聰，李軍營

（1.南京農(nóng)業(yè)大學生命與科學學院，南京 210032；2.云南煙草農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)藝部，云南 玉溪 653100；3.中國煙草總公司湘潭中等專業(yè)學校，湖南 湘潭 411103；4.云南省煙草昆明市公司，昆明 650051）

光照強度是生態(tài)系統(tǒng)過程的基本驅動因素，影響作物光合作用和初級生產(chǎn)速率［1］。光照強度在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中作物的生長和發(fā)育方面起著重要作用，其變化可能導致作物中化學物質合成代謝的重新調整［2-3］。優(yōu)質烤煙生長需要充足且適宜的光照［4］，在云南6—7月，此時云煙87正處于烤煙旺長期，烤煙所需適宜光強為3.0～5.0萬lx，光照不足會導致烤煙株高降低，葉片長和寬等農(nóng)藝性狀指標降低，不利于煙堿合成，從而降低烤煙煙葉內在品質［4-5］。

弱光照對煙株生長特性有顯著影響［6］。適宜的遮陰可調節(jié)煙葉的蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度，有利于煙葉的光合作用，促進煙葉內含物的形成［7］。劉柏林等［6］研究表明，遮光顯著降低煙株HY06和K326株高和莖圍，現(xiàn)蕾期有效葉片數(shù)顯著降低，煙葉凈光合速率、氣孔導度、葉片光合放氧速率顯著降低，胞間二氧化碳濃度顯著升高。弱光照對煙株化學物質合成代謝有顯著影響［8］。強光照處理會使烤煙植株中煙堿總含量降低，中上部煙葉尤其如此［9］。研究表明，適度遮陰會提高煙葉煙堿含量，重度遮陰到采收后期煙堿含量則降低，而3層白色聚乙烯紗網(wǎng)遮陰的上部葉和中部葉煙堿含量維持在一個比較穩(wěn)定的范圍［10］。適宜的光照有利于提高烤煙評吸質量，初烤煙葉化學成分更協(xié)調，利于優(yōu)質煙葉的形成，而弱光照條件顯著影響烤煙葉片煙堿水平［11］。前期研究僅局限于光照強度對煙株農(nóng)藝性狀、光合參數(shù)及常規(guī)化學成分含量的影響［12-15］，但遮陰度對烤煙煙堿合成的影響機理仍不明確。

本課題組推測遮陰對煙葉煙堿含量影響是由煙堿前體、中間物質含量及煙堿合成酶基因相對表達水平的差異所致。為了驗證此假設，本研究在大田試驗中通過覆蓋不同層數(shù)遮陰網(wǎng)以設置不同遮陰強度，從煙堿合成通路的角度分析遮陰度對煙堿前體、中間物質合成及煙堿合成酶基因表達量的影響，進一步探究遮陰對煙堿合成的影響機制，以期為烤煙煙堿的合成調控提供理論依據(jù)及生產(chǎn)指導。

1 材料和方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗時間為2018年10月到2020年8月（包括預實驗)，試驗地設在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院研和基地。供試紅壤情況：pH為6.2，速效氮8.04 mg·kg-1，速效磷 12.6 mg·kg-1，速效鉀 70.4 mg·kg-1。供試材料為云南主栽烤煙品種云煙87。

1.2 試驗設計

不同遮光強度通過覆蓋不同層數(shù)的遮陽網(wǎng)（尼龍網(wǎng)，孔徑50 mm，透光率為60%）來實現(xiàn)。試驗設4個處理，對照組（CK）為100%自然光，光強在 1 250～2 000 μmol·m-2·s-1；L1處理遮 1層遮陽網(wǎng)，控制光強分別在 890～1 380 μmol·m-2·s-1，約70%自然光，輕度遮陰；L2處理遮2層遮陽網(wǎng)，控制光強分別在 560～910 μmol·m-2·s-1，約 45% 自然光，中度遮陰；L3處理遮3層遮陽網(wǎng)，控制光強分別在 260～420 μmol·m-2·s-1，約20%自然光，重度遮陰。各處理設置3個重復，隨機區(qū)組排列。烤煙采用漂浮育苗，于6葉1心時移栽。在移栽20 d后進行遮陽網(wǎng)覆蓋處理，遮陰40 d后打頂，直至遮陰后75 d。烤煙大田試驗管理按照云南省優(yōu)質烤煙生產(chǎn)栽培管理技術標準執(zhí)行。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 光合特性測定 光合特性的測定時間為遮陰后20 d（旺長期）、40 d（打頂期前1 d）、60 d（下部葉采烤期前1 d）的10：00—12：00，分別選取倒第6、8、10片葉，使用LI-6400XT便攜式光合作用測量系統(tǒng)（美國LI-COR公司）測定。光合特性測定指標包括凈光合速率（μmol·m-2·s-1）、胞間CO2濃度（μmol·mol-1）、氣孔導度（mmol·m-2·s-1）、蒸騰速率（mmol·m-2·s-1）等。

1.3.2 煙堿及煙堿前體、中間物質含量測定 分別于煙株遮陰處理后15、25、35、45、55、65、75 d（除煙堿中間物質含量）取樣，進行生化指標的測定。用連續(xù)流動分析儀［法國Alliance（AMS集團）公司］測定云煙87根、莖、葉的煙堿含量。用Agilent 1100 HPLC高效液相色譜（美國安捷倫公司）測定根系煙堿前體和中間物質含量。

1.3.3 煙堿合成酶基因表達水平測定 采用TRIZOL法提取0.1 g根尖細胞總RNA，提取方法參照Total RNA Extraction Kit（北京索萊寶科技有限公司）說明書。隨后參照Universal RT-PCR Kit（北京索萊寶科技有限公司）說明書合成煙草根尖細胞cDNA。用RT-PCR方法分析煙堿合成酶基因的表達水平，包括腐胺-N-甲基轉移酶（putrescine N-methyltransferase）基因NtPMT、喹啉酸磷酸核糖基轉移酶（quinolinate phosphoribosyl transferase）基因NtQPT、N-甲基腐胺氧化酶（N-methylputrecine oxidase）基因NtMPO和精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase）基因NtADC。RTPCR反應采用熒光染料SYBR Green I（上海萌芽生物科技有限公司）在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，PCR程序如下：95℃30 s預變性；95℃5 s，60℃34 s，循環(huán)40次。然后用熔解曲線檢驗擴增效率，基因引物用PrimerPremier5.0設計，見表1。最后用2-△△Ct的方法計算基因的相對表達水平。

表1 熒光定量PCR引物設計Table 1 List of primers used for the qRT-PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 24.0軟件對試驗中所得到的數(shù)據(jù)做Duncan多重檢驗（Duncan’s multiple range test），采用Origin2018作圖。

2 結果與分析

2.1 不同遮陰處理對烤煙葉片光合特性的影響

由表2可知，遮陰20 d后，與對照相比，L1處理的煙葉凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度分別增加10.42%、35.85%、5.44%，而L3處理的相應指標分別降低38.80%、52.83%、3.89%，表明適當遮陰有助于烤煙葉片進行光合作用，重度遮陰時，光合作用反而降低，不利于烤煙生長。遮陰40 d后，烤煙葉片凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率隨遮陰度增大而逐漸降低，L3處理降幅最大，分別為39.94%、71.43%、40.41%。遮陰處理60 d與遮陰處理40 d的相應光合生理指標結果相反。所有處理煙葉胞間CO2濃度隨烤煙生育期的推進呈先降后升趨勢，整體呈單峰曲線，這可能是由遮陰40 d后烤煙處于現(xiàn)蕾期光合作用較大所致。

表2 不同遮陰處理對烤煙中部腰葉光合特性的影響Table 2 Effect of different shading treatments on photosynthetic characteristics of middle waist leaf of flue-cured tobacco

2.2 不同遮陰處理對烤煙各器官中煙堿含量的影響

圖1顯示，遮陰15～55 d，根部煙堿含量隨生育期推進呈現(xiàn)先升高、后降低、再升高、最后降低的趨勢，即呈雙峰曲線。遮陰后45 d，由于打頂操作剛完成，處理L1、L2、L3的根部煙堿含量比對照高，L2處理增幅最大，為53.19%。遮陰55～75 d，處理L3的根部煙堿含量最低，與對照相比分別降低3.33%、16.92%、11.48%，表明重度遮陰降低現(xiàn)蕾期烤煙根系煙堿含量。遮陰15～55 d，與對照相比，L3處理顯著降低烤煙莖部煙堿含量，分別為29.87%、43.97%、15.83%、21.05%、6.91%。對下部葉而言，遮陰后15 d，葉片煙堿含量隨遮陰度增大而逐漸降低，最大降幅為45.05%；而遮陰75 d后葉片煙堿含量與遮陰15 d后的結果相反，最大增幅為160.44%。對中部葉而言，除遮陰45、65 d后，與對照相比，L1、L2處理烤煙葉片煙堿含量各生育期均無顯著差異，表明輕中度遮陰對中部葉煙堿含量幾乎無影響。值得注意的是，烤煙各器官中，所有處理在遮陰55 d時，煙堿含量與其他天數(shù)相比都較低，說明處于現(xiàn)蕾末期的烤煙煙堿合成在急劇降低。

圖1 不同遮陰處理對烤煙各器官煙堿含量的影響Fig.1 Effect of different shading treatments on the nicotine content in organs of flue-cured tobacco

2.3 不同遮陰處理對烤煙根部煙堿中間物質含量的影響

從圖2結果可知，遮陰15～45 d，與對照相比，L1處理降低根部腐胺含量分別為36.77%、11.37%、2.84%、5.71%，但差異不顯著。而遮陰55～65 d，L1、L2處理根部腐胺含量都高于對照CK，L2處理增幅最大，分別為14.31%、6.44%。遮陰25～65 d，與對照相比，所有遮陰處理烤煙根部精胺含量都較高，說明遮陰有利于精胺的合成。CK、L1、L2處理的根部精胺含量隨生育期推進呈先升、后降、再升趨勢，呈雙峰曲線，且分別在遮陰后45、65 d達到高峰值。遮陰15～25 d，與對照相比，L1處理的根部亞精氨含量分別降低30.47%、4.46%，而L2、L3處理顯著增加亞精氨含量，分別是對照的2.16、1.99倍。遮陰35～65 d，與對照相比，L1、L2、L3處理的根部亞精氨含量增加，說明烤煙旺長期以后遮陰處理有利于亞精氨合成，最大增幅分別為147.64%、173.78%、73.89%、82.69%。遮陰25～65 d，與對照相比，L2、L3處理顯著增加多胺含量，最大增幅分別為 40.05%、36.14%、36.27%、23.47%、162.40%。

圖2 不同遮陰處理對烤煙根系煙堿中間物質含量的影響Fig.2 Effect of different shading treatments on the nicotine intermediate content at root of flue-cured tobacco

2.4 不同遮陰處理對烤煙根部煙堿前體物質含量的影響

圖3結果顯示，遮陰15～55 d，L2、l3處理的烤煙根部天冬氨酸含量都高于對照，最大增幅分別為7.01%、25.65%、253.85%、22.70%、89.28%。遮陰65～75 d，L3處理降低天冬氨酸含量幅度最大分別為27.20%、37.52%。遮陰15～65 d，所有遮陰處理的根部精氨酸含量隨生育期推進呈先降、后升、再降的趨勢，第1個低峰值和高峰值分別出現(xiàn)在遮陰后35、45 d。除遮陰35 d外，L1、L3處理甲硫氨酸含量都比對照降低。在遮陰55 d后，所有遮陰處理的烤煙根部甲硫氨酸含量急劇下降，根部煙堿含量急劇下降相呼應。遮陰35～55 d，與對照相比，L2、L3處理烤煙根部游離氨基酸含量都顯著增加，最大增幅分別為38.88%、25.67%、20.72%。

圖3 不同遮陰處理對烤煙根系煙堿前體物質含量的影響Fig.3 Effect of different shading treatments on the nicotine precursor content at root of flue-cured tobacco

2.5 不同遮陰處理對烤煙根系煙堿合成酶基因表達的影響

從圖4可以看出，遮陰15、55 d后，QPT基因相對表達量隨遮陰度增大而逐漸降低，最大降幅分別為50%、83%；遮陰35 d時，所有遮陰處理現(xiàn)蕾期烤煙根系QPT基因相對表達量都高于對照，分別比對照增加74%、31%、27%。遮陰25～55 d，與對照相比，L2或L3處理顯著增加PMT基因相對表達量，最大增幅分別為283.80%、85.97%、67.17%、54.59%。遮陰25～65 d，與對照相比，L3處理MPO基因相對表達量顯著增加，最大增幅分別為155.62%、164.26%、67.17%、98.59%、34.40%。遮陰15～45 d，與對照相比，L2或L3處理顯著增加ADC基因相對表達量，最大增幅分別為85.97%、181.83%、103.93%、54.59%；遮陰45～65 d，與對照相比，L1處理顯著增加ADC基因相對表達量，增幅分別為70.28%、110.53%。

圖4 不同遮陰處理對烤煙根系煙堿合成酶基因表達的影響Fig.4 Effect of different shading treatments on nicotinic synthase gene expression at root of flue-cured tobacco

3 討論

不同遮陰程度對煙株葉片光合特性產(chǎn)生不同影響［16］。王子騰［17］研究認為，烤煙上部葉光合強度、氣孔導度和蒸騰速率均隨光照強度升高呈先升后降趨勢，而本研究結果表明，烤煙旺長期中部葉凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率隨遮陰度增大而逐漸降低，重度遮陰處理降幅最大，各指標降幅分別為39.94%、71.43%、40.41%。這可能是由本研究中光強范圍處于煙葉光飽和點以下所致。

煙堿在根系中合成，且根系和葉片中煙堿都能通過去甲基化降解，但主要在衰老葉片中降解［18］。烤煙中煙堿的累積受到環(huán)境因素、栽培技術、植物激素水平等影響［19-20］。適度遮陰可提高煙葉煙堿含量，重度遮陰到采收后期煙堿含量則降低，而3層遮陰上部葉和中部葉煙堿含量維持在比較穩(wěn)定的范圍［10］。遮陰15～55 d，根部煙堿含量隨生育期推進呈現(xiàn)先升高、后降低、再升高、最后降低的趨勢，呈現(xiàn)雙峰曲線。第1個高峰值出現(xiàn)在遮陰25 d，可能因為在其中一條通路下NtADC和NtPMT表達量增加，導致由精氨酸合成精胺的含量升高，最后在PMT酶的作用下合成煙堿；另一條通路下隨腐胺合成量和NtPMT表達量的增加，煙堿合成量增加，由于兩條通路的共同作用導致煙堿合成量急劇增加［21］。第2個低峰值出現(xiàn)在遮陰55 d，可能因為天冬氨酸含量和NtQPT表達量大幅度下降，導致煙堿合成量急劇下降［21］。遮陰25～55 d，中重度遮陰處理增加烤煙根部腐胺、精胺、亞精胺及多胺含量，表明該處理導致前體物質精氨酸含量較低，而精氨酸脫羧酸基因NtADC表達量較高，由此合成的中間物質（多胺類）含量高。遮陰15～55 d，中重度遮陰處理的烤煙根部天冬氨酸含量都高于對照，中重度遮陰最大增幅分別為 7.01%、25.65%、253.85%、22.70%、89.28%，這與劉典三［22］的研究結果基本一致，表明中重度遮陰處理不利于烤煙葉片的氨基酸向蛋白質的同化及蛋白質的轉運，降低了氮素同化水平。本研究結果證實，遮陰25～55 d，重度遮陰處理的烤煙根部天冬氨酸、精氨酸、腐氨、精氨、亞精胺含量都高于對照，煙堿含量卻降低，可能因為其中一條通路為由天冬氨酸在NtQPT作用下合成煙酸，再合成煙堿；另一條通路為精氨酸經(jīng)過NtADC合成精胺，再由精胺合成煙堿［23］。當精氨酸、精胺和天冬氨酸含量累積時，煙堿的合成受阻。

煙堿生物合成是代謝途徑中多基因共同作用的結果［23-24］。目前為煙堿合成提供吡咯烷環(huán)的通路有3條，第1條通路為精氨酸經(jīng)過ADC酶的作用合成精胺轉化為N-氮甲酰基腐胺，其為煙堿合成提供吡咯烷環(huán)；第2條通路為由鳥氨酸經(jīng)過鳥氨酸脫羧酶作用合成腐胺，再由PMT和MPO酶的作用合成N-甲基吡咯啉，其為煙堿提供吡咯烷環(huán)；第3條通路為由蛋氨酸經(jīng)過S-腺苷甲硫氨酸合成酶的作用合成S-腺苷蛋氨酸，再由PMT和MPO酶的作用合成N-甲基吡咯啉，其為煙堿提供吡咯烷環(huán)。目前為煙堿合成提供吡啶環(huán)的通路有1條，先由天冬氨酸轉化為喹啉酸，后在QPT酶的作用下轉化為煙酸，其為煙堿提供吡啶環(huán)［24］。但是目前尚無關于遮陰度對烤煙煙堿合成調控影響機理的報道。本研究闡明，遮陰15～45 d，與對照相比，中重度遮陰顯著增加NtADC基因相對表達量，最大增幅分別為85.97%、181.83%、103.93%、54.59%，由此說明了中重度遮陰處理下精氨酸含量高而精胺含量也高的原因。遮陰25～55 d，中重度遮陰處理顯著增加NtPMT基因相對表達量，最大增幅分別為283.80%、85.97%、67.17%、54.59%，且重度遮陰處理顯著增加NtMPO基因相對表達量分別為155.62%、164.26%、67.17%、98.59%，由此說明了中重度遮陰處理下腐胺含量高而煙堿含量低的原因。遮陰35 d時，所有遮陰處理烤煙現(xiàn)蕾期根系NtQPT基因相對表達量都高于對照，分別比對照增加74%、31%、27%，由此說明了不同遮陰處理下天冬氨酸含量高而煙堿含量低的原因。