枯草芽孢桿菌Czk1揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌的抑菌機理

梁艷瓊，李銳，吳偉懷，習金根，譚施北，黃興，陸英，賀春萍，易克賢

（中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，農業農村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海南省熱帶農業有害生物檢測監控重點實驗室，海口 571101）

紅根病是危害嚴重的世界性橡膠樹根部病害，在我國熱區各個植膠區內普遍發生[1]。其病原菌為橡膠靈芝菌[Ganodermapseudoferreum(Wakef.)Over.et Steinm]，具有潛伏期長、寄主范圍廣、在土壤中蔓延迅速和防治困難的特點，是限制我國橡膠單產提高的重要生物因子，近年來危害愈加嚴重[2-4]。當前生產上主要采用十三嗎啉灌根防治，其價格昂貴，且長期使用導致病菌產生抗性，從而防效下降[5]，因此，迫切需要開發新的防治途徑。生物防治因具有環境友好、對非靶標生物安全的特點而越來越受到重視。研究表明，微生物源揮發性物質具有抑制病原菌的效果[6-8]。揮發性物質（volatile organic compounds，VOCs）是一類小分子、易揮發的有機或無機化合物，在一定溫度和壓力條件下揮發后能防治有害生物，避免了二次污染，在抑菌、殺蟲及除草等方面都得到廣泛應用。Zheng等[9]報道，短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）TB09和蘇云金桿菌（B.thuringiensi）TB72產生的揮發性物質2-壬酮、2-苯乙胺、甲基辛基甲酮對炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporiodes）具有強抑制作用。Zhang等[10]研究發現，綠針假單胞菌金色亞種（Pseudomonaschlororaphissubsp.aureofaciens）SPS-4揮發性物質異戊醇、苯乙醇和2-甲基丁醇對甘薯塊根黑腐病菌（Ceratocystis fimbriata）具有較好的抑制作用。Wu等[11]報道，白色鏈霉菌（Streptomycesalbulus）NJZJSA2揮發性物質4-甲氧基苯乙烯、2-戊基呋喃和茴香醚具有抗真菌活性。劉元元等[12]研究發現，芽孢桿菌（Bacillusspp.)X4和N4產生的揮發性物質2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和異丁酸對棉花黃萎菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）有抑菌活性。

枯草芽孢桿菌Czk1菌株由本課題組分離自橡膠樹根部，其揮發性物質對橡膠樹紅根病菌（G.pseudoferreum）、褐根病菌（Phellinusnoxius）、紫根病菌（Helicobasidiumcompactum）、白根病菌（Rigidopruslignosus）、臭根病菌（Sphaerostilbe repens）和炭疽病菌（C.gloeosporiodes）具有較好的抑制作用[13]；同時，該菌株產生的苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚具有較好的抑菌作用；揮發物混合活性物質質量濃度為25 μg·mL-1時，對橡膠靈芝菌抑制率為67.07%，當質量濃度為100 μg·mL-1時，其抑制率為87.21%[14]。然而，Czk1揮發物混合活性組分作用機理尚未明確。為了探討Czk1菌株揮發性物質對橡膠靈芝菌的抑制機理，拓寬對真菌互作機制的認識，在揮發性物質苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚混合組分作用于橡膠靈芝菌后，通過測定菌絲細胞中糖類、蛋白物質、DNA和關鍵代謝酶活性的變化，尋找混合活性組分對橡膠靈芝菌的抑制途徑，從而為新型農藥的研制與橡膠樹根病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養基及供試病原菌 LB培養基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

PDB培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

供試病原菌：橡膠樹紅根病菌GP030由本課題組分離、鑒定和保存。

1.1.2 試驗藥劑 99.50%苯甲醛、98.00%2,6-二叔丁基對甲酚和DMF（用于溶解2,6-二叔丁基對甲酚、3,5-二甲氧基苯乙酮）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；98.00%3,5-二甲氧基苯乙酮購自百靈威科技有限公司。揮發性組分苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚按照GC-MS的測定結果（苯甲醛：3,5-二甲氧基苯乙酮：2,6-二叔丁基對甲酚=7:8:1）人工合成[14]。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞內容物泄露情況測定 設置4個處理：處理 1（T1）為質量濃度 25 μg·mL-1揮發物活性組分，處理2（T2）為100 μg·mL-1揮發物活性組分，對照組為DMF和清水。將橡膠靈芝菌接入二分格培養皿一側，28℃培養8 d后，在另一側培養皿放入揮發物混合活性組分，在0、12、24、36、48、60 h時取樣，用5 mL無菌水清洗菌體，12 000 r·min-1離心2 min，用紫外分光光度計（SPECORD 200 PLUS，德國耶拿）測定各處理組的OD260值。試驗重復3次。

1.2.2 橡膠靈芝菌糖含量和蛋白質含量檢測 參照陳毓荃[15]和黃蓉等[16]方法，將橡膠靈芝菌新鮮菌塊接入PDB培養基中，28 ℃、180 r·min-1震蕩培養7 d，濾出菌絲，無菌水沖洗后分裝到另一批PDB三角瓶中。處理組瓶子上空放入濃度為25、100 μg·mL-1揮發物混合活性組分無菌濾紙（30 mm）后迅速封口，對照組不加入揮發物活性組分。各處理均在28 ℃、180 r·min-1條件下培養，8 d 后過濾菌絲，用無菌水洗滌后，烘干稱重備用。稱取等量上述不同處理的橡膠靈芝菌菌絲，采用葡萄糖溶液滴定法分別測定各處理橡膠靈芝菌的總糖含量和還原糖含量；制作蛋白標準曲線，采用雙縮脲法測定不同處理的橡膠靈芝菌菌絲蛋白質含量[15]。試驗重復3次。

1.2.3 橡膠靈芝菌蘋果酸脫氫酶、幾丁質酶活性測定 采用蘋果酸脫氫酶試劑盒和幾丁質酶試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）測定橡膠靈芝菌的蘋果酸脫氫酶、幾丁質酶活性。

取培養7 d的處理組和對照組菌絲體各1 g，液氮研磨破碎后，加入6 mL HEPES緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液）浸提10 min，4℃、14 000 r·min-1離心20 min，取上清夜依照試劑盒步驟測定蘋果酸脫氫酶活性。

稱取處理組和對照組的菌絲體各0.3 g，液氮研磨，加入5 mL預冷的提取緩沖液，4℃、14 000 r·min-1離心30 min，保留上清液，按照幾丁質酶試劑盒步驟測定其活性。

1.2.4 橡膠靈芝菌丙二醛含量測定 利用丙二醛檢測試劑盒（TBA比色法）測定橡膠靈芝菌的丙二醛含量。在二分格培養皿含PDA培養基的一側接入橡膠靈芝菌，培養8 d后，在另一側接入揮發物混合活性組分，分別于1、3、5和7 d時收集各處理菌絲，用磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌3次，4℃離心收集菌絲體。稱取0.1 g濕菌絲，加入液氮，冰浴下研磨至勻漿，依照試劑盒步驟測定丙二醛的含量。試驗重復3次。

1.2.5 DNA孵育測定 將橡膠靈芝菌接入二分格培養皿一側含PDA的平板中間，在二分格培養皿另一側分別加入25和100 μg·mL-1的揮發物活性組分，于28℃培養15 d后收集菌絲，采用OMEGA真菌DNA提取試劑盒提取橡膠靈芝菌的DNA，以不加揮發物活性組分為對照處理。試驗重復3次，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌細胞內容物泄露情況的影響

從圖1可以看出，清水和DMF對照組在整個實驗過程中吸光值變化不大，一直保持在0.1～0.2范圍內，整體趨于平穩的趨勢；不同質量濃度的揮發物混合活性組分處理后，隨著處理時間的延長，橡膠靈芝菌細胞內容物泄露（吸光度值）不斷增加，T1和T2兩個處理之間差異顯著（P＜0.01），T2處理60 h時達到了0.999，而T1處理在60 h時為0.788，細胞內容物的泄漏量隨著揮發物混合活性組分質量濃度的增大而增大。表明處理組的細胞內溶物泄漏明顯，且不同質量濃度對橡膠靈芝菌細胞內容物泄露情況的影響不同。

圖1 揮發物混合活性組分處理后橡膠靈芝菌細胞內容物泄露情況Fig.1 Cellular content leakage of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

2.2 揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌糖類含量的影響

由圖2可知，橡膠靈芝菌菌絲體中的還原糖含量隨揮發物混合活性組分質量濃度升高而降低。DMF和清水對照處理中橡膠靈芝菌菌絲體中的還原糖含量分別為4.12%和4.33%，兩對照組差異不顯著。T1和T2處理組的還原糖含量分別下降為3.12%和2.36%，兩處理組差異顯著（P＜0.01），且均與對照組差異極顯著（P＜0.01）。由此可見，一定質量濃度的揮發物混合活性組分可降低橡膠靈芝菌還原糖含量，T2處理的糖含量更低，表明高質量濃度揮發物混合活性組分可顯著影響橡膠靈芝菌還原糖含量。

DMF和清水對照組的總糖含量分別為30.12%和31.45%，T1和T2處理的總糖含量分別為27.45%和20.23%，與對照組相比，總糖含量分別下降了10.83%和34.29%，與對照組差異顯著（P＜0.01），且不同質量濃度兩處理間差異顯著。總之，橡膠靈芝菌總糖含量呈現隨揮發物混合活性組分質量濃度升高而降低的變化趨勢。

2.3 揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌和蛋白質含量的影響

經揮發物混合活性組分處理后，橡膠靈芝菌菌絲蛋白質含量隨著處理質量濃度的增大而減少，且比對照組含量降低。T1處理蛋白質含量為49.12 μg·mL-1，DMF、清水對照處理的蛋白質含量分別為53.22和51.88 μg·mL-1，其與對照組無顯著差異，說明低質量濃度揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌菌絲中蛋白質的合成無顯著影響；T2處理的蛋白質含量為43.25 μg·mL-1，顯著低于對照組（P＜0.01）（圖3）。由此可知，高質量濃度的揮發物混合活性組分影響橡膠靈芝菌蛋白質的合成。

圖3 揮發物混合活性組分處理后橡膠靈芝菌蛋白含量變化Fig.3 Protein content of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

2.4 揮發物混合活性組分對蘋果酸脫氫酶、幾丁質酶活性的影響

由圖4可知，T1和T2處理蘋果酸脫氫酶活性分別是 0.209 和 0.183 U·g-1·min-1，差異極顯著（P＜0.01），隨著揮發物混合活性組分質量濃度增大，橡膠靈芝菌蘋果酸脫氫酶的活性降低。DMF和清水對照的蘋果酸脫氫酶活性分別為0.248和0.256 U·g-1·min-1，兩對照組差異不顯著，處理組和對照組差異極顯著（P＜0.01），說明揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌蘋果酸脫氫酶活性影響較大，可能是通過影響細胞三梭酸循環，從而引起代謝途徑的變化。

圖4 揮發物混合活性組分處理后橡膠靈芝菌蘋果酸脫氫酶和幾丁質酶的含量Fig.4 Activity of malate dehydrogenase and chitinase of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

經揮發物混合活性組分處理后，橡膠靈芝菌幾丁質酶活性降低，且揮發物混合活性組分質量濃度越高，活性降低越明顯。當揮發物混合活性組分質量濃度為25 μg·mL-1（T1）時，幾丁質酶活性 為 4.736 U·g-1·s-1，質量濃度為100 μg·mL-1（T2）時，活性降低至4.06 U·g-1·s-1，兩處理間差異達極顯著（P＜0.01）。DMF和清水對照的幾丁質酶活性較高，但兩者間差異不顯著，處理組和對照組差異達到極顯著（P＜0.01）。上述結果表明，揮發物混合活性組分可顯著影響幾丁質酶的活性，從而影響能量代謝的關鍵作用。

2.5 揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌細胞中丙二醛含量的影響

由圖5可知，DMF和清水對照在0～7 d內，丙二醛含量變化不明顯，且隨著時間的延長，丙二醛含量平穩。T1和T2處理呈現緩慢上升的趨勢，在第5天達到最大值，分別為116.45和85.56 mmol·g-1，顯著高于對照組（P＜0.01），且隨著處理質量濃度的增大和時間的延長，丙二醛含量增加，兩個處理間差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 揮發物混合活性組分處理后橡膠靈芝菌的丙二醛含量Fig.5 Malondialdehyde content of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

2.6 揮發物混合活性組分對橡膠靈芝菌DNA的影響

由圖6可知，不同質量濃度的揮發物混合活性組分，其DNA條帶不一樣，隨著質量濃度的增大，DNA條帶隨之減弱，表明DNA含量降低。揮發物混合活性組分處理的基因組DNA的分子量沒有明顯改變，說明揮發物混合活性組分并未破壞橡膠靈芝菌的一級結構。

圖6 揮發物混合活性組分處理后橡膠靈芝菌的DNAFig.6 DNA of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

3 討論

微生物的細胞膜可以控制細胞內、外營養物質和代謝產物的運送，維持細胞的正常生命活動，同時能夠協助抵抗外源物質侵入，在遭受外界破壞后，細胞膜發生變化，內部電解質、糖類、蛋白質等生物大分子發生泄露[17]。真菌細胞膜是活性物質作用的靶位，活性物質能改變菌絲體細胞膜的穩定性，導致其結構受損，內含物外滲，從而達到抑菌效果[18]。阮元等[19]報道，小麥赤霉菌細胞結構受到鹽酸小檗堿破壞胞內物質外滲,從而造成可溶性蛋白質含量增高。蘆慧等[20]研究發現，鏈霉菌702菌株所產抗真菌單體組分DZP8可使水稻紋枯病菌細胞可溶性糖和蛋白質滲漏。曾志紅等[21]報道，丁香乙醇提取物導致枝孢霉菌(Cladosporiumsp.)電導率上升、菌絲可溶性蛋白質含量增加。董玉鵬等[22]發現，綠葉揮發性物質反式-2-己烯醛可嚴重破壞梨果黑斑病菌（Alternariaalternata）細胞膜的完整性，膜電導率和核酸滲出率顯著增加。本研究發現，當揮發性活性物質作用于橡膠靈芝菌后，菌絲中總糖隨揮發物混合活性組分質量濃度的升高而降低，一定濃度的揮發組分可降低橡膠靈芝菌還原糖含量，與阮元等[19]、蘆慧等[20]報道基本一致。高質量濃度的揮發物混合活性組分影響橡膠靈芝菌蛋白質的合成，低質量濃度的無顯著影響，這一結果與曾志紅等[21]報道蛋白質含量增加有些不同，可能是不同物質作用靶標不一樣，且作用對象不同，其結果也不一樣。本研究中丙二醛含量隨著處理質量濃度的增大和處理時間的延長而增大，其含量增加反映了菌絲細胞膜結構受損害的程度。這些結果說明，當真菌細胞受到揮發物混合活性組分的作用時，細胞膜為了應對新的環境會對其組分進行調整，如內溶物的釋放、丙二醛含量等。這一過程的發生是基于細胞膜的損壞，而且隨著揮發物混合活性組分的質量濃度升高，細胞受損情況加重，表明揮發物混合活性組分能夠破壞細菌的細胞膜從而達到抑菌效果。

蘋果脫氫酶是檸檬酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸，也可催化胞漿中草酰乙酸形成蘋果酸。蘋果脫氫酶還參與細胞多種生理活動，包括線粒體的能量代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統、抗病性以及抗病過程中的活性氧代謝等[23]。蘋果脫氫酶活性能反映細胞代謝是否正常，袁勇軍等[24]報道，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Y-6產抗菌肽可降低桃軟腐菌(Rhizopusstolonifer)琥珀酸脫氫酶和蘋果脫氫酶的活性,抑制桃軟腐菌的呼吸代謝或利用營養物質酶的生物合成。陳玉環等[25]研究表明，桂枝主要抑菌活性物質肉桂醛和肉桂酸能顯著降低意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)的蘋果酸脫氫酶活性，從而使細胞能量代謝活動無法正常進行，或使細胞死亡。幾丁質是真菌細胞壁的重要結構物質，其合成和水解代謝影響著細胞壁的功能。邢介帥等[26]研究發現，枯草芽孢桿菌所產生的蛋白酶對棉花枯萎病菌菌絲生長具有抑制作用,推測可能是蛋白酶降解了棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf）細胞壁中的蛋白質，造成細胞壁缺損，在膨脹壓的作用下菌體發生變形。本研究發現，當揮發物混合活性組分作用于橡膠靈芝菌后，顯著影響細胞蘋果酸脫氫酶、幾丁質酶活性，與前面報道的基本一致[24-26]。不同的是，上述報道僅是某種物質作用從而使某個關鍵酶失去活性，而揮發物混合活性組分是由不同活性物質混合組成的，其作用靶標不同，可同時侵入細胞，使細胞壁和細胞膜受損。細胞表面受到不同程度的損壞，隨著揮發混合活性組分質量濃度和作用時間的增加，細胞通透性增強，內溶物流出后進入細胞內部，影響生命大分子物質蛋白質和核酸的合成，使細胞功能受損，生長和增殖受到抑制，從而改變代謝途徑。

本研究發現，苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚揮發混合活性組分可有效抑制橡膠靈芝菌，造成糖類、蛋白質物質的減少從而影響細胞的穩定；同時，能較好抑制能量代謝相關酶（蘋果酸脫氫酶、幾丁質酶）活性，使能量代謝過程受阻。揮發混合活性物質的抑菌機理可能主要是通過破壞細胞膜結構、擾亂代謝活動來實現的。本研究僅是在細胞水平上研究混合活性物質作用機理，關于揮發性活性物質的更多作用機制還需深入研究。