舍曲林對腸易激綜合征大鼠cAMP/PKA通路及腸道炎癥反應的影響①

范紅云 段志英 趙亞男 楊春春 楊明月 張 梅 霍曉輝 白 云 王 競（河北醫科大學第一醫院消化內科，石家莊 050031）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是最常見胃腸道疾病之一，在多數國家成年人中發病率高達10%～20%，以慢性或復發性腹痛、腹瀉、排便習慣和大便性狀異常為主要癥狀，尚無特異性治療方案，嚴重威脅患者生活質量和生命健康［1-2］。舍曲林為抗抑郁藥物，隨著對其藥理作用的不斷研究，發現其對IBS治療效果良好，且安全性較高［3］。舍曲林和去甲替林聯合作用可保護由氧化應激引起的大鼠結腸黏膜上皮細胞損傷［4］。環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/環磷酸腺苷依賴性蛋白激酶A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA）是細胞內經典途徑之一，在介導細胞各種刺激反應中起關鍵作用，可通過調節受體、離子通道、轉錄因子活性調節生物細胞活性。IBS 可通過cAMP/PKA 途徑調節炎癥因子釋放、免疫系統激活和液態水代謝異常［5］。但舍曲林對IBS 大鼠cAMP/PKA 通路及腸道炎癥反應的影響尚未見報道。本研究采用母嬰分離加醋酸灌腸聯合結直腸擴張刺激法制備大鼠IBS 模型，并給予舍曲林治療，旨在從cAMP/PKA 通路揭示舍曲林對IBS 大鼠腸道炎癥反應的影響，為IBS治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar 孕鼠8 窩購自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0009。實驗動物使用遵循國家《實驗動物管理條例》并通過動物倫理委員會批準。按照3R原則給予實驗動物人道關懷照顧。飼養條件：22℃，55%濕度，12 h光/12 h暗循環。

1.1.2 主要試劑和儀器 舍曲林（50 mg，批準文號：H20051553）購自輝瑞制藥有限公司；匹維溴銨（50 mg，批準文號：H20120127）購自法國得舒特公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和β-actin 鼠抗購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、ECL 顯色試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；cAMP、PKA、CREB、p-CREB 鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 二抗均購自美國Abcam 公司；酶標儀Fax-20100 購自美國INStat 公司；尼康SMZ745 光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；蛋白凝膠成像儀、轉膜儀和電泳儀購自美國Bio-Rad 公司；脫水機、包埋機、石蠟切片機和染色機均購自湖北惠達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 IBS大鼠模型構建與分組 采用覃穎等［6］母嬰分離加醋酸灌腸聯合結直腸擴張刺激法構建大鼠IBS模型：幼年大鼠出生后第2～21天每日進行3 h母子分離；幼年大鼠出生后第8～21天將經石蠟潤滑后直徑為1 mm 的中心靜脈導管緩慢插入幼鼠肛門約2 mm處，0.5%醋酸灌腸，隨著日齡增長灌注量逐漸增加，其中第8～10 天灌注0.2 ml，第11～12 天灌注0.3 ml，第13～15 天灌注0.4 ml，第16～17 天灌注0.5 ml，第18～19 天灌 注0.6 ml，第20～21 天灌 注0.7 ml；第22～24 天不進行任何干擾；當幼鼠發育至25 d 時，母子分籠正常飼養；幼鼠發育至42 d 時，給予1 次結直腸擴張刺激：將經石蠟潤滑后的6F 導尿管插入大鼠肛門6～7 cm 處后固定，待大鼠適應后，均勻緩慢向導尿管中注入0.5 ml蒸餾水（0.5 ml/min）以擴張結直腸并維持30 s，使大鼠腹部抬起，為提高造模成功率和模型穩定性，實驗重復3次，每次間隔5 min；將大鼠正常飼喂至8 周齡。根據其糞便和行為學進行篩選：當大鼠腹瀉且精神狀態與正常大鼠存在明顯差異時，表明模型制備成功［7］。將造模成功大鼠隨機分為模型組、舍曲林低、中、高劑量（10、20、30 mg/kg）組［8］、陽性對照組（匹維溴銨，2 mg/kg）［9］，每組15只，另取15只正常大鼠作為對照組。大鼠發育至9 周齡時開始灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積生理鹽水，其他各組給予相應藥物，2次/d，連續10 d，10 ml/kg。

1.2.2 各組大鼠一般情況、糞便含水量和排便時間 大鼠給藥結束12 h 內，觀察大鼠精神狀態、飲食、行為活動等一般情況并記錄，各組大鼠提尾，進行排便刺激，離心管采集大鼠糞便，稱重記錄，同時記錄排便時間，大鼠糞便烘干后再次稱重并記錄，計算大鼠糞便含水率。

1.2.3 腹部撤回反射（abdominal withdrawal reflex，AWF）評分法檢測大鼠內臟敏感性 對各組大鼠持續進行提尾刺激，使其排盡糞便后，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg/kg）輕度麻醉，將經石蠟潤滑后帶球囊且未充氣的導管從大鼠肛門緩慢插入，使球囊末端距肛門約1 cm 處并固定于大鼠尾根部。每只大鼠給予球囊擴張3 次，擴張容量分別為1.0、1.5、2.0 ml，每次擴張持續30 s，重復3 次，根據AWF 評分標準（0 分：大鼠情緒基本穩定，未出現敏感現象；1 分：大鼠情緒變得不穩定，偶爾扭轉頭部；2 分：大鼠腹背部肌肉輕微收縮，但腹部未抬離地面；3 分：大鼠腹背部肌肉較強烈收縮，腹部抬離地面；4 分：大鼠腹背部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形，腹部和會陰部均抬離地面）取平均值并進行統計分析，分值越高表明大鼠內臟敏感性越強。

1.2.4 HE 染色觀察各組大鼠結腸組織病理學變化 1.2.2和1.2.3實驗結束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）深度麻醉后處死大鼠，分離大鼠結腸組織，每組取5只大鼠結腸組織（其余大鼠結腸組織迅速置于-80℃冰箱用于ELISA 和Western blot檢測），4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，為使組織切片與載玻片貼合更緊密，需在60℃下烤片2 h，依次切片，脫蠟入水，染色，30℃烘干30 min，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 ELISA 檢測各組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP 含量取1.2.4中置于-80℃冰箱中的大鼠結腸組織，每組0.05 g，低溫融化，加入9 倍體積預冷后的PBS 勻漿，13 000 r/min 離 心15 min，取上清，按照IL-1β、TNF-α、IL-6 和cAMP ELISA試劑盒說明書操作，每組設3個重復。

1.2.6 Western blot 檢測各組大鼠結腸組織cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表達 取1.2.4 中置于-80℃冰箱中的各組大鼠剩余結腸組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量，SDS-PAGE 電泳，轉膜，抗體封閉，加入1∶2 000 稀釋后的cAMP、PKA、CREB 和p-CREB 鼠抗4℃孵育過夜，含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL 顯色，凝膠成像儀拍照，以β-actin 為參照，分析灰度值，得到蛋白表達，每組設3個重復。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 舍曲林對IBS 大鼠一般情況、排便時間和糞便含水量的影響 對照組大鼠精神狀態良好，發育正常，皮毛光亮。與對照組相比，模型組大鼠精神狀態較差，情緒煩躁易怒，活動較少，排便時間顯著縮短（P＜0.05），糞便含水量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠異常狀態逐漸改善，排便時間依次延長（P＜0.05），糞便含水量依次降低（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽性對照組差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠排便時間及糞便含水率比較（，n=15）Tab.1 Comparison of defecation time and fecal water content of rats in each group（，n=15）

表1 各組大鼠排便時間及糞便含水率比較（，n=15）Tab.1 Comparison of defecation time and fecal water content of rats in each group（，n=15）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.2 舍曲林對IBS大鼠內臟敏感性的影響 如表2所示，與對照組相比，模型組大鼠內臟敏感性顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠內臟敏感性依次降低（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽性對照組大鼠內臟敏感性差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠內臟敏感性比較（，n=15，分）Tab.2 Comparison of visceral sensitivity of rats in each group（，n=15，score）

表2 各組大鼠內臟敏感性比較（，n=15，分）Tab.2 Comparison of visceral sensitivity of rats in each group（，n=15，score）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.3 舍曲林對IBS 大鼠結腸組織病理學變化的影響 對照組大鼠結腸組織腸黏膜屏障結構完整，無炎癥因子浸潤；模型組大鼠結腸組織出現明顯水腫，腸黏膜完整性受損，出現大量炎癥細胞浸潤；舍曲林低、中、高劑量組大鼠結腸組織水腫逐漸消除，腸黏膜趨于完整，炎癥細胞浸潤逐漸減少；舍曲林高劑量組與陽性對照組大鼠結腸組織病理學變化無顯著差異（圖1）。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學HE染色（×200）Fig.1 HE staining of colon tissue pathology of rats in each group（×200）

2.4 舍曲林對IBS 大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP 含量的影響 如表3 所示，與對照組相比，模型組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著升高，cAMP 含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量依次降低，cAMP 含量依次升高（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽性對照組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP 含量差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP含量比較（，n=15）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cAMP levels in colonic tissue of rats in each group（，n=15）

表3 各組大鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP含量比較（，n=15）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cAMP levels in colonic tissue of rats in each group（，n=15）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.5 舍曲林對IBS 大鼠結腸組織cAMP、PKA 蛋白表達及CREB 磷酸化水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠結腸組織cAMP、PKA 蛋白表達及CREB 磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠結腸組織cAMP、PKA 蛋白表達及CREB 磷酸化水平依次升高（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽性對照組大鼠結腸組織cAMP、PKA 蛋白表達及CREB 磷酸化水平差異無統計學意義（P＞0.05，圖2、表4）。

圖2 各組大鼠cAMP、PKA和CREB蛋白表達Fig.2 cAMP，PKA and CREB protein expressions of rats in each group

表4 各組大鼠結腸組織中cAMP、PKA 蛋白表達及CREB磷酸化水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of cAMP，PKA protein expressions and CREB phosphorylation level in colon tissue of rats in each group（，n=10）

表4 各組大鼠結腸組織中cAMP、PKA 蛋白表達及CREB磷酸化水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of cAMP，PKA protein expressions and CREB phosphorylation level in colon tissue of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

3 討論

隨著社會經濟發展和人們生活習慣改變，IBS發病率不斷上升，但其產生的病因尚不明確，由于IBS 并發抑郁和焦慮的風險較高，因此，精神心理異常和腸道刺激因素可能是產生IBS 的主要因素，其中心理應激與IBS 發生和復發密切相關［10］。IBS 發病機制可能由于細胞內氧化應激產生，進而降低結腸收縮性，從而導致結腸損傷［11］。本研究采用母嬰分離加醋酸灌腸聯合結直腸擴張刺激法制備大鼠IBS 模型，結果發現，模型組大鼠精神狀態較差，情緒煩躁易怒，活動較少，結腸組織出現明顯水腫，結腸黏膜完整性受損，出現大量炎癥細胞浸潤，排便時間和結腸組織中cAMP 含量顯著降低（P＜0.05），糞便含水量、內臟敏感性、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著升高（P＜0.05），提示IBS大鼠模型構建成功，且產生結腸組織炎癥反應。

舍曲林主要用于治療抑郁癥相關疾病，包括焦慮癥、狂躁癥等，且能有效防止癥狀復發，具有較高的安全性和耐受性。隨著對其藥理作用的不斷研究，發現給予潰瘍性結腸炎伴抑郁患者鹽酸舍曲林聯合美沙拉秦治療后，可有效緩解患者抑郁癥狀，且能改善潰瘍性結腸炎［12］。焦慮患者經舍曲林治療后，其促炎細胞因子IL-1α、IL-6、IL-8 含量顯著下降［13-14］。本研究發現，經舍曲林干預后，IBS 大鼠不良癥狀逐漸緩解，排便時間、cAMP 含量顯著升高（P＜0.05），糞便含水量、內臟敏感性、TNF-α、IL-1β和IL-6 含量顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，提示舍曲林可能通過減輕結腸組織炎癥反應緩解大鼠IBS，但其機制尚需進一步研究。

cAMP/PKA 信號通路可介導細胞外信號與相應受體結合，調控第二信使cAMP 水平，引發下游事件，主要過程是通過活化cAMP 依賴的PKA 導致下游靶蛋白磷酸化，從而影響細胞代謝和行為，使細胞快速應答胞外信號。王瑩等［15］研究發現，大鼠胃腸組織基于cAMP/PKA 信號轉導通路的變化與大鼠脾氣虛證模型顯著相關。YU 等［16］研究發現，白藜蘆醇可通過激活腸-腦軸中5-羥色胺依賴的PKA/CREB 信號，改善IBS引起的抑郁、焦慮、內臟超敏和腸道運動異常等癥狀。LI 等［17］研究發現，利拉魯肽通過上調cAMP/PKA 信號通路調節星形細胞極化，減輕炎癥反應，進而保護非酒精性脂肪肝。結直腸癌中，激活cAMP/PKA 通路可抑制腫瘤血管生成和血管生成擬態［18］。磷酸二酯酶抑制劑可通過cAMP/PKA/CREB 信號轉導和抗炎作用逆轉轉基因小鼠學習和記憶缺陷［19］。另外，木犀草素可能通過PKA 改善IBS［20］。而PKA 蛋白激酶信號通路參與應激反應誘導的內臟敏感性［21］。本研究發現舍曲林可顯著提高大鼠結腸組織cAMP、PKA 蛋白表達及CREB 磷酸化水平，提示舍曲林可能通過上調cAMP/PKA 通路減輕大鼠腸道炎癥反應，進而延緩大鼠IBS發展。

綜上所述，舍曲林可能通過劑量依賴性上調cAMP/PKA 通路減輕大鼠腸道炎癥反應，進而延緩IBS 發展，為臨床舍曲林治療IBS 提供了依據，但舍曲林對IBS的作用機制十分復雜，尚需深入研究。