雙氫青蒿素通過抑制HMGB2 表達及逆轉EMT 進程抑制肝癌細胞生長及侵襲①

楊晨雪 魏雁虹 魏海峰 米旭光 宋 帥 李 明 耿 輝 楊廣民（長春中醫藥大學，長春 130021）

原發性肝癌是臨床最常見的消化系統惡性腫瘤之一，全球發病率逐年上升［1-2］。與其他惡性腫瘤細胞相比，肝癌細胞具有更強的侵襲及遷移能力，因此具有起病隱匿、進展迅速等特點［3］。患者出現癥狀就診時往往已處于晚期而錯過最佳手術時機，導致肝癌患者預后和生存率均不理想。研究證實，高遷移率族蛋白2（high mobility group box 2，HMGB2）在肝癌細胞中表達增加，其高表達可促進肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞增殖，提高其侵襲能力［4］。新近研究表明，HMGB2 還可能是一種新型上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）介導物［5］。EMT 過程使腫瘤細胞獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力，與腫瘤轉移和復發密切相關［6］。逆轉這一過程是抗腫瘤新藥篩選的目標之一。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）分子式為C15H24O5，分子量為284.35，為含過氧化基團的倍半萜內酯化合物，是1973年屠呦呦為鑒定青蒿素化學結構中具有羰基而創制的第一個青蒿素還原衍生物，隨著研究不斷深入，發現其不僅具有抗瘧活性，還具有抗炎、抗腫瘤、抗肺纖維化等作用，甚至具有調節免疫抗腫瘤作用，在抗腫瘤復發方面亦顯示出較好的應用前景，但對其抗腫瘤作用機制尚缺乏系統研究［7］。本文通過體外實驗觀察DHA 對肝癌細胞生長及遷移、侵襲的抑制作用，并從DHA 對HMGB2 表達及EMT 進程影響的角度分析其抗腫瘤作用機制，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 人肝癌細胞株HepG2 由吉林省人民醫院中心實驗室提供；人肝癌細胞株LM3（WHELAB C1010）購自上海盈灣生物科技有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 DHA 購自北京索萊寶科技有限公司；順鉑購自江蘇豪森藥業股份有限公司；高糖培養基DMEM 購自德國BRAND 公司；胎牛血清（FBS）購自美國CLARK公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Gibco 公司；甲基噻唑藍（MTT）購自美國Sigma 公司；細胞凋亡試劑盒、RIPA 裂解液均購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell 小室購自Corning公司；一抗與二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2 和LM3 細胞均采用含10%FBS 及1%青霉素鏈霉素雙抗的DMEM 培養基于37℃、5%CO2孵育，當細胞達到80%～100%融合時消化傳代，選取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 MTT 檢測細胞存活率 取對數增長期HepG2 細胞株制備細胞懸液，采用完全培養基將細胞濃度稀釋為10×105個/ml，接種于96孔板，100μl/孔，繼續培養24 h 至細胞完全貼壁，分別加入0、2.5、5、10、20、40μg/ml 順鉑溶液處理24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度順鉑在不同時間對HepG2 細胞存活率的影響。按照同樣方法，采用0、20、40、80、160、320 mmol/L DHA 處理HepG2 細胞24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度DHA 在不同時間對HepG2 細胞存活率的影響。同理，采用0、40、80、160、320、640μg/ml順鉑溶液處理LM3 細胞24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度順鉑在不同時間對LM3 細胞存活率的影響，以及采用0、40、80、160、320、640 mmol/L DHA 處理LM3 細胞24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度DHA 在不同時間對LM3 細胞存活率的影響。以上實驗每組均設5 個復孔，24 h 后加入MTT（20μl/孔），4 h 后棄培養基，100 μl/孔加入DMSO，振蕩混勻5 min 后酶標自動分析儀測定490 nm處吸光度。

1.2.3 劃痕實驗 取對數生長期HepG2 細胞接種于6 孔板，24 h 后細胞融合度達100%時，用槍頭小側劃破細胞中軸，分別加入含2.5 μg/ml 順鉑和20 μmol/L DHA 的無血清DMEM 培養基，并設置陰性對照組。同理，用含40 μg/ml 順鉑和40 μmol/L DHA的無血清DMEM 培養基處理LM3細胞，并設置陰性對照組。以上實驗每組設2個重復。0 h、24 h、48 h、72 h時顯微鏡拍攝劃痕愈合程度。

1.2.4 侵襲實驗 采用含5%FBS的DMEM 培養基將HepG2細胞制成1×105個/ml細胞懸液，各Transwell小室上層加入100μl 細胞懸液，小室下室分別加入含2.5 μg/ml 順鉑、20 μmol/L DHA 的含10%FBS 的DMEM 培養基500μl，并設立陰性對照。同理用含5%FBS的DMEM培養基將LM3細胞制成1×105個/ml細胞懸液，各Transwell 小室上層加入100μl 細胞懸液，小室下室加入含40 μg/ml 順鉑、40 μmol/L DHA的含10%FBS 的DMEM 培養基500 μl，并設立陰性對照。培養48 h 后進行蘇木精、伊紅染色，顯微鏡拍照計數。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數生長期HepG2細胞接種于6孔板，24 h后分別加入含10、20 μg/ml 順鉑、80、160 μmol/L DHA 的完全培養基，并設置陰性對照組。同理，采用含40、80μg/ml順鉑和80、160 μmol/L DHA 的完全培養基處理LM3 細胞，并設置陰性對照組。24 h 后PBS 洗滌2 次，采用不含EDTA 的胰酶消化，收集細胞，Annexin V/PI雙染色法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot 取對數生長期HepG2 和LM3細胞制成細胞懸液，并分為兩組，HepG2 細胞組采用2.5 μg/ml 順鉑處理以及20 μmol/L DHA 處理；LM3 細胞組采用40 μg/ml 順鉑處理以及40 μmol/L DHA 處理。48 h 后將上述細胞加入適量蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，進行SDA-PAGE 電泳，轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入Caspase-3、Cleavedcaspase3、Bax、Bcl-2、HMGB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，第2天用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，顯影儀顯影，分析。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學分析，計量資料采用表示，兩組間連續變量比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DHA 對肝癌細胞存活率的影響 MTT 檢測結果顯示，隨著順鉑以及DHA 藥物濃度提高，與陰性對照組相比，順鉑組以及DHA 組細胞存活率顯著降低（P＜0.05，圖1A）。HepG2細胞在2.5μg/ml順鉑、20μmol/L DHA及LM3細胞在40μg/ml 順鉑、40μmol/L DHA 同一藥物濃度作用時，培養24 h、48 h、72 h，隨著時間增加細胞存活率顯著降低（P＜0.05，圖1B）。

圖1 DHA對HepG2和LM3細胞存活率的影響Fig.1 Effects of DHA on survival rate of HepG2 and LM3 cells

2.2 DHA 對肝癌細胞遷移能力的影響 與陰性對照組相比，順鉑及DHA 處理的兩組細胞24 h 時HepG2 細胞和LM3 細胞遷移率明顯降低，48 h、72 h時，兩組細胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01，圖2）。

圖2 DHA對HepG2和LM3細胞遷移的影響Fig.2 Effects of DHA on migration of HepG2 and LM3 cells

2.3 DHA 對肝癌細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗結果顯示，兩種肝癌細胞經過順鉑以及DHA 處理后，侵入小室的腫瘤細胞數明顯少于陰性對照組（P＜0.001，圖3）。

圖3 DHA對HepG2和LM3細胞侵襲的影響Fig.3 Effects of DHA on invasion of HepG2 and LM3 cells

2.4 DHA 對肝癌細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組（0.03%）相比，隨著順鉑和DHA藥物濃度增加，肝癌細胞凋亡率逐漸提高。80、160μmol/L DHA 作用于HepG2 細胞24 h 后，凋亡率分別為5.84%和81.26%（P＜0.05），80、160 μmol/L DHA 作用于LM3 細胞24 h 后，凋亡率分別為7.61%和24.70%（P＜0.05，圖4）。Western blot 結果顯示，與陰性對照組相比，兩種肝癌細胞經過順鉑和DHA作用48 h 后，Cleaved-caspase3、Bax 表達明顯增加，Bcl-2表達顯著降低（P＜0.05，圖5）。

圖4 DHA對HepG2和LM3細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of DHA on apoptosis of HepG2 and LM3 cells

圖5 DHA 對HepG2 和LM3 細 胞Caspase-3、Cleavedcaspase3、Bax及Bcl-2蛋白表達的影響Fig.5 Effects of DHA on expressions of Caspase-3，Cleaved-caspase3，Bax and Bcl-2 proteins in HepG2 and LM3 cells

2.5 DHA 對HMGB2 以及EMT 相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，DHA 可顯著抑制肝癌細胞HMGB2 表達（P＜0.05），且在兩種肝癌細胞實驗中均發現，與陰性對照組相比，DHA 處理組、順鉑組E-cadherin表達增加，而N-cadherin、Vimentin 表達降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 DHA 對HepG2 和LM3 細 胞HMGB2 及EMT 相 關蛋白表達的影響Fig.6 Effects of DHA on expressions of HMGB2 and EMT related proteins in HepG2 and LM3 cells

3 討論

原發性肝癌治療過程中化療藥物有效率低、不良反應大，導致肝癌患者預后較差，遠期療效不盡如人意。尤其是常用的鉑類化療藥物易產生耐藥性，且不能特異性針對腫瘤細胞，對自身正常細胞有較大危害，因此急需探索一種對人體傷害較小的新型藥物［8］。DHA在多種腫瘤研究中被證實具有抗腫瘤作用或與其他化療藥物一起產生協同增效作用［9-10］。本研究通過體外實驗，采用不同濃度DHA 作用于HepG2 和LM3 兩種不同人肝癌細胞，24～72 h 后觀察DHA 對肝癌細胞增殖的抑制作用，結果發現DHA 可顯著抑制肝癌細胞生長，且DHA 劑量越大、作用時間越長，肝癌細胞存活率越低，且呈時間-劑量依賴性。常規化療藥物順鉑在兩種不同肝癌細胞中顯示出不同抗腫瘤作用，對于高轉移潛能的肝癌LM3細胞，需要更大劑量才能發揮殺傷作用（HepG2和LM3 細胞IC50分別為13.79 及336.12 μg/ml），這種選擇性抗腫瘤作用可以解釋為什么臨床使用相同含鉑化療方案但不同患者間療效不盡相同。腫瘤在個體間的異質性決定部分肝癌患者可能需要更大的順鉑劑量才能達到治療效果，而在實際臨床應用中，高劑量化療藥物同樣會帶來巨大副作用和不良反應，一直是腫瘤治療的難點。而本研究發現，DHA 不僅與一定劑量的順鉑化療藥物具有相同功效的抗腫瘤作用，且對兩種不同類型肝癌細胞的生長抑制作用差異不大（HepG2 和LM3 細胞IC50分別為143.89 及242.12μmol/L），顯示出較好的臨床應用前景。

為探究DHA 抑制肝癌細胞生長的原因，本研究通過流式細胞技術和Western blot 實驗發現，DHA可促進肝癌細胞凋亡，并促進肝癌細胞凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3、Bax 表達，Bcl-2 表達降低，且DHA 對HepG2 細胞凋亡的影響與劑量聯系密切，20μmol/L DHA 作用于HepG2 細胞24 h 時細胞凋亡率為5.09%，與對照組（0.03%）差異有統計學意義（P＜0.05），濃度為40 μmol/L 時細胞凋亡率為5.44%，80 μmol/L DHA 時細胞凋亡率為5.84%，而160 μmol/L 時細胞凋亡率則達到81.26%，說明DHA 對肝癌細胞凋亡的影響在一定濃度范圍內作用區別不大，但DHA 在更高濃度后對肝癌細胞HepG2 的影響顯著提高，但對LM3 細胞卻無此趨勢，可能是腫瘤細胞異質性導致藥物作用效果不同。當然，由于藥物吸收利用度的關系，體內外實驗存在巨大差別，對于成藥可能性而言，160μmol/L有效藥物濃度過大，尚無法有力說明其有多顯著的抗腫瘤作用，有待后續通過動物實驗進一步研究。

此外，本研究通過劃痕及侵襲實驗驗證了DHA對肝癌細胞侵襲及轉移的影響，結果顯示，DHA 處理后肝癌細胞遷移及侵襲能力顯著降低，提示DHA可有效對抗肝癌復發和轉移。同時發現，與對照組相比，DHA 處理組HMGB2 表達明顯降低，說明HMGB2 可能是DHA 抑制肝癌細胞增殖、侵襲及遷移的靶點。近年人們發現HMGB2 在胃癌、膠質母細胞瘤和胰腺癌中高表達，是一種可在炎癥反應、細胞分化、細胞遷移與侵襲中發揮重要作用的細胞外信號分子［11］。LI 等［12］敲除胃癌細胞MALAT1 發現，HMGB2 表達顯著降低，細胞增殖及侵襲能力減弱；WU 等［13］通過對敲低HMGB2 的3 種膠質母細胞瘤細胞進行檢測后發現，3 種細胞遷移和侵襲能力均不同程度減弱，且侵襲相關標志物p53、MMP2 和TIMP2 表達減少；CAI 等［14］構建了抑制HMGB2 表達的胰腺癌細胞系后發現，糖酵解相關蛋白GLUT1、HK2 和LDHA mRNA 表達相對陰性對照組明顯降低，說明HMGB2 可促進胰腺癌細胞糖酵解和增殖。劉愛蕙等［15］通過靶向沉默乳腺癌細胞HMGB2 表達，實驗組較空白對照組侵襲癌細胞數明顯減少，提示HMGB2 與癌細胞增殖及侵襲相關。高遷移率族蛋白廣泛分布于真核生物的單核巨噬細胞核，屬于免疫性非組蛋白，既往研究表明其與過敏性紫癜、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等免疫性疾病密切相關。HMGB2是一種炎癥誘導因子，通過誘導腫瘤細胞炎癥因子持續產生形成慢性炎癥狀態，促進免疫抑制微環境形成。DHA 具有免疫調節作用，可能通過調節HMGB2 表達干擾腫瘤免疫微環境，可能是DHA 與其他化療藥物協同增效作用的機制之一，值得深入研究。

EMT 是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在癌癥轉移過程中發揮重要作用。為進一步探討DHA 抑制肝癌細胞遷移及侵襲能力的機制，本研究觀察了DHA 對肝癌細胞EMT進程的影響，結果發現DHA處理后的肝癌細胞E-cadherin 表達顯著增加，N-cadherin、Vimentin 表達明顯減少，可有效逆轉肝癌EMT 進程。且本研究發現順鉑對肝癌細胞EMT 進程同樣具有一定抑制作用，類似的研究結果也有報道。如王績英等［16］發現肺癌A549細胞中順鉑單獨使用可抑制A549細胞增殖，減弱A549 細胞遷移侵襲運動能力，同時上調E-cadherin mRNA 及蛋白表達。錢亞云等［17］發現人肝癌細胞HepG2 中順鉑可抑制肝癌細胞增殖，縮短遷移距離，降低N-cadherin、Vimentin表達，同時增加E-cadherin蛋白表達。但長期大量應用順鉑導致腫瘤細胞耐藥后，順鉑反而會加速EMT進程。如楊丞等［18］研究表明，長時間順鉑誘導的宮頸癌耐藥細胞株發生了EMT，可以解釋順鉑在初期應用時療效很好，但一旦發生耐藥，腫瘤復發和轉移依舊不可避免，因此抗腫瘤中藥和順鉑聯用就顯得非常必要。

近年研究中，NAVID等［5］用HSP90抑制劑處理黑色素瘤細胞后發現，HSP90 抑制劑可通過EMT 相關NF-κB信號通路調節HMGB2表達，提示HMGB2表達與黑色素瘤細胞發生EMT 密切相關。YUAN 等［19］發現丹參酮可抑制胃癌細胞EMT 進程，HMGB2 高表達可促發胃癌細胞EMT。HAN 等［20］發現HMGB2在結直腸癌中過表達，沉默長鏈非編碼RNACRCMSL可釋放HMGB2，并將其重新定位于細胞核與Oct4結合，進而上調結直腸癌細胞EMT 相關基因表達，故可通過促進結直腸癌細胞HMGB2 表達促發EMT。提示HMGB2可能是EMT的上游靶點。

綜上所述，DHA 可抑制肝癌細胞存活，并通過激活Caspase-3 誘導肝癌細胞凋亡，并通過下調HMGB2 表達抑制EMT 發生，從而阻礙肝癌細胞侵襲及遷移，在抗肝癌治療及控制肝癌復發轉移方面顯示出巨大潛力。DHA 對肝癌作用的其他機制、體內作用情況如何以及治療劑量下的毒副作用仍需進一步研究。