Ad-apoptin通過AMPK/ACC信號通路抑制肺癌細胞脂代謝①

宋高杰 尚 超 李一權 朱羿龍 金寧一 李 霄（延邊大學醫學院，延吉 133002）

肺癌是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，數據顯示2020 年我國肺癌新發病例82 萬例，死亡病例71 萬例（http：//gco.iarc.fr）。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要組織類型，約占所有肺癌的80%［1］。在惡性腫瘤的發生、發展過程中，腫瘤細胞需要攝取及合成大量的脂類物質以滿足其細胞生理活動及合成細胞膜主要組成成分［2］。研究表明腫瘤細胞普遍存在糖脂代謝紊亂現象，即Warburg 效應，表現為攝入葡萄糖量增高、糖酵解活性增強和乳酸堆積。脂代謝異常在肺癌、乳腺癌、結腸癌和其他腫瘤中被廣泛研究［3-5］。最近研究發現通過降低肺癌ACSS2 介導的乙酰輔酶A活性和組蛋白H4乙酰化抑制脂質合成，從而抑制肺癌細胞生物學功能的新機制［6］。因此，降低腫瘤細胞脂代謝為治療肺癌提供了新的研究思路。

凋亡素（apoptin）是雞貧血病毒VP3 基因的產物，是一種長13.6 kD 的小蛋白，具有選擇性殺傷多種人類腫瘤或轉化細胞的能力，對正常細胞沒有毒性作用［7］。在先前的研究中，本課題組構建了表達Apoptin的重組人5型腺病毒，并將其命名為Ad-VP3（Ad-apoptin），已被證明可在腫瘤細胞中有效的表達Apoptin［8］。AMPK 是細胞能量感應和恢復代謝平衡的關鍵調節因子[9]。而ACC 是AMPK 的底物，為脂肪酸的生物合成提供丙二酰輔酶A 底物，丙二酰輔酶A 被磷酸化關閉，被去磷酸化激活[10]。本研究中，首次發現AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）-乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）信號通路與Ad-apoptin 誘導的肺癌細胞凋亡密切相關。從機制上講，Ad-apoptin 激活肺癌細胞中的AMPK，進而觸發凋亡和ACC 抑制。抑制ACC 有助于Ad-apoptin 降低細胞脂代謝，從而增強細胞凋亡。以上結果表明，Ad-apoptin 通過AMPK/ACC 信號轉導脂代謝來促進肺癌細胞凋亡，為研究脂代謝重編程與細胞凋亡之間的相互作用提供了新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒和動物 A549 和NCI-H23 細胞系購自上海生物科學研究所細胞庫。重組溶瘤腺病毒（Ad-mock 和Ad-apoptin）由實驗室（中國農業科學院長春獸醫研究所）構建并保存。雌性BALB/c裸鼠購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心，所有動物實驗方案均由中國農業科學院長春獸醫研究所動物護理與使用委員會（IACUC）批準。所有手術均在戊巴比妥鈉麻醉下進行，符合標準實驗動物操作程序。

1.1.2 主要試劑 CCK-8 試劑盒（日本同仁化學，貨號：CK04）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD 生物科技，貨號：556547）；riboFECT CP（Ribobio，貨號：C10511-05）；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）（上海雅酶生物科技，貨號：PG112）；MinuteTM總蛋白提取試劑盒（Invent Biotechnologies，貨號：SD001/SN002）；Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit（CST，貨號：8335T）；改良油紅O染色試劑盒（碧云天，貨號：C0158S）；三酰甘油（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）（南京建成，貨號：A111-1-1 和A110-1-1）；PARP（CST，貨號：9532s）；TOFA（MCE，貨號：HY-101068）；AMPK（CST，貨號：5831）；Apoptin（Abcam，貨號：ab193612）。

1.1.3 主要儀器 SUNRISE 多功能酶標儀購自瑞士Tecan 公司；蛋白印跡電泳儀、轉膜儀和顯影儀購自美國Bio-Rad 公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；Accuri C6 Plus 流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 取對數期NSCLC A549 和NCIH23細胞，以5×105個/孔接種于6孔板。當達到60%融合時，根據riboFECT CP 說明書分別將si-NC 和si-AMPK 質粒轉染到細胞中。轉染48 h 后，收集細胞用于后續測定。

1.2.2 Western blot 用MinuteTM總蛋白提取試劑盒從肺癌細胞（A549 和NCI-H23）中提取總蛋白后用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白30μg 通過10%SDS-PAGE 分離后，轉至PVDF 膜（0.45 μm）上。用5%BSA 快速封閉液封閉20 min，加入PARP、FASN、Lipin1、ACSL1、AceCS1、p-ACL等兔來源的單克隆一抗（1∶1 000 稀釋）4℃孵育過夜，TBST 清洗4 次，每次8 min，加入對應山羊抗兔二抗（1∶3 000 稀釋）室溫孵育40 min，用TBST 清洗4 次，每次8 min，然后，滴加ECL顯色并曝光拍照。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 用預冷PBS 清洗收集的細胞，向細胞沉淀中加入1×Binding Buffer工作液并重懸細胞，將細胞濃度調整至1×106個/ml。取200 μl 細胞懸液，離心后加入300 μl 含有5 μl Annexin V-FITC 和10μl PI的1×Binding Buffer，避光室溫孵育20 min后用流式細胞儀檢測。

1.2.4 油紅O染色 取處理后的細胞，加入染色洗滌液覆蓋細胞20 s，吸除染色洗滌液，加入適量油紅O 染色工作液，避光染色15 min 后用PBS 清洗2 次，在倒置顯微鏡下觀察細胞脂質積累情況。

1.2.5 TG和TC 含量測定 將A549 和NCI-H23 細胞以6×105個/孔的濃度分別接種到6 孔板中，在37℃、5%CO2下培養18 h，分別感染150 MOI Ad-mock和Ad-apoptin。按照說明檢測細胞TG和TC相對含量。

1.2.6 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP） 將含有蛋白酶抑制劑的預冷IP 細胞裂解液加入至收集的細胞中，4℃裂解30 min，離心后用BCA法測定蛋白濃度，取上清液變性后用于input。向對照（Control）組蛋白上清液中加入1.0 μg IgG 和20 μl Protein A/G 珠子，Ad-apoptin 組加入20 μl Protein A/G 珠子，4℃孵育1 h；離心后取上清，加入抗體后4℃孵育過夜；加入80 μl Protein A/G-珠子，4℃孵育2 h；離心后收集免疫沉淀復合物；將免疫沉淀復合物用1 ml 預冷的IP 裂解液（不含抑制劑）洗滌4 次，每次離心后吸去上清液，加入80μl 1×還原型上樣緩沖液，沸水煮10 min，離心取10μl 上清用于Western blot檢測。

1.2.7 動物實驗 在每只裸鼠右腿皮下接種NSCLC A549 細胞1×107個，接種7 d 后出現米粒大小質硬結節即為NSCLC 荷瘤小鼠模型構建成功，將建模成功小鼠隨機分為Control 組和Ad-apoptin 組。Ad-apoptin 組瘤內給藥1×107PFU Ad-apoptin，Control 組瘤內注射等體積生理鹽水，1 次/3 d，連續治療4 周。第30 天時，在戊巴比妥鈉麻醉下頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，免疫組化檢測Ki-67，TUNEL，p-AMPK和FASN陽性表達。

1.3 統計學分析 數據通過Graphpad Prism 8軟件進行統計學處理分析，兩組比較采用Student's 法檢驗，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05代表差異有統計學意義。數據以3個或更多獨立樣本的表示。

2 結果

2.1 Ad-apoptin抑制肺癌細胞的活性 CCK-8結果顯示，Ad-apoptin呈劑量依賴性抑制細胞增殖（圖1），而空載體Ad-mock 對肺癌細胞無顯著抑制作用。Ad-apoptin 在A549 和NCI-H23 細胞中處理24 h 的IC50約為150 MOI（圖1），該劑量用于后續實驗。

圖1 Ad-apoptin抑制肺癌細胞的活性Fig.1 Ad-apoptin inhibits cell viability of lung cancer cells

2.2 Ad-apoptin 誘導肺癌細胞凋亡 為了研究Adapoptin 對肺癌細胞的細胞凋亡作用機制，采用JC-1染色法檢測了Ad-apoptin 作用于A549 和NCI-H23細胞后細胞的凋亡情況。結果表明，Control 組和Ad-mock組中的大多數細胞呈紅色，而在Ad-apoptin處理組（圖2A）中可觀察到紅色熒光的消失及綠色熒光的增加，表明Ad-apoptin 具有誘導線粒體膜電位下降的能力，而線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。Annexin V-FITC/PI結果顯示，Ad-apoptin 使A549 和NCI-H23 細胞的凋亡率分別增加了27.4%和33.2%（圖2B）。此外，經Adapoptin 處理的這兩種細胞系中，裂解的PARP 的水平升高（圖2C）。以上數據表明Ad-apoptin能有效誘導肺癌細胞凋亡。

圖2 Ad-apoptin誘導肺癌細胞凋亡Fig.2 Ad-apoptin induces apoptosis of lung cancer cells

2.3 Ad-apoptin 通過抑制AMPK 依賴的ACC 抑制肺癌細胞的脂質代謝 為了進一步闡明Ad-apoptin對AMPK 信號的作用，通過Western blot 檢測Adapoptin 處理前后肺癌細胞脂肪酸合成代謝相關分子的變化。經Ad-apoptin 處理的A549 和NCI-H23細胞中ACC 的磷酸化水平顯著增加，而FASN、Lipin1、ACSL1、AceCS1和p-ACL蛋白表達顯著降低，這表明Ad-apoptin可能通過抑制ACC 活性來下調脂肪生成（圖3A）。為了驗證這一點，用油紅O 染料對A549 和NCI-H23 細胞脂質進行染色。如圖3B 所示，在沒有Ad-apoptin 處理的情況下，可觀察到大量脂質累積。相反，經Ad-apoptin 處理后的細胞中脂質積累明顯減少（圖3B）。與Control 組比較，Adapoptin 的TG（圖3C）和TC（圖3D）的相對含量顯著降低（P＜0.01）。結果表明Ad-apoptin 主要是通過AMPK抑制ACC進而抑制肺癌細胞的脂質代謝。

圖3 Ad-apoptin 通過抑制AMPK 依賴的ACC 抑制肺癌細胞的脂質代謝Fig.3 Ad-apoptin suppresses lipid metabolism of lung cancer cells by AMPK-dependent ACC inhibition

2.4 AMPK/ACC 信號通路參與Ad-apoptin 誘導肺癌細胞凋亡 本課題組研究了Ad-apoptin 在AMPK/ACC 信號通路中誘導細胞凋亡的重要性。數據顯示，si-AMPK 減弱 了Ad-apoptin 誘導的p-ACC 的增加，這也顯著緩解了Ad-apoptin 誘導A549 和NCIH23細胞的凋亡（圖4A、C）。TOFA 可轉化為TOFyl-CoA，并對ACC 產生抑制作用。TOFA 與Ad-apoptin共同作用于A549和NCI-H23細胞后，與單獨處理相比，細胞凋亡增加，p-ACC 磷酸化增強（圖4B、D），這表明Ad-apoptin 促進肺癌細胞的凋亡高度依賴于AMPK/ACC 信號。為了探討Apoptin 與AMPK 的關系，進行了Co-IP 實驗。結果見圖4E，外源性Apoptin 被AMPK 沉淀，提示Apoptin 與AMPK 相互作用。

圖4 AMPK-ACC 信號通路參與Ad-apoptin 誘導肺癌細胞凋亡Fig.4 AMPK-ACC signaling contributes to Ad-apoptininduced apoptosis of lung cancer cells

2.5 Ad-apoptin 對體內腫瘤生長的抑制作用 在A549 裸鼠移植瘤中，Ad-apoptin 組腫瘤體積明顯低于Control 組（P＜0.01，圖5A）。在30 d 治療過程中，2 個實驗組中的裸鼠體質量無顯著性差異，說明Ad-apoptin 沒有產生明顯的毒性（圖5B）。同時Ad-apoptin組生存率明顯高于Control組（圖5C）。免疫組化結果表明，與Control 組相比，Ad-apoptin 組Ki-67 蛋白表達量顯著下降，而TUNEL 蛋白表達量與之相反（圖5D，P＜0.01）。Ad-apoptin 組p-AMPK蛋白表達量高于Control 組，而FASN 的表達量低于Control組，與體外實驗結果一致（圖5E）。

圖5 Ad-apoptin對體內腫瘤生長的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of apoptin on tumor growth in vivo

3 討論

肺癌是全世界惡性腫瘤相關發病率和病死率的主要原因［11］。為了降低病死率，必須尋找一種副作用少、療效顯著的治療方法。隨著分子生物學技術的不斷發展，分子靶向治療成為人們關注的焦點。代謝重編程，包括Warburg 效應（葡萄糖攝取增加、有氧糖酵解和乳酸產生）和脂質代謝異常，在惡性腫瘤的增殖和轉移中起著重要作用［12-13］。因此，分析代謝異常，尋找“代謝靶點”已成為惡性腫瘤治療的新策略。

溶瘤腺病毒能選擇性感染殺傷腫瘤細胞，已成為抗腫瘤新藥的又一研究熱點［14］。本課題組早期研究發現Ad-apoptin 主要針對腫瘤細胞，對正常人體細胞無副作用，安全性高［7］。在以往的研究中，發現Ad-apoptin 通過內源性途徑誘導腫瘤細胞凋亡，還可以影響腫瘤細胞的自噬和增加活性氧［7，15-16］。這些與腫瘤細胞的殺傷密切相關，然而溶瘤腺病毒對腫瘤脂代謝的機制尚不清楚。本研究發現Ad-apoptin 通過AMPK 的激活和細胞凋亡在肺癌細胞中顯示出很強的抗癌活性。Ad-apoptin 上調AMPK/ACC 信號通路降低脂質代謝，促進肺癌細胞的凋亡。這一新的機制探索了抑制AMPK 依賴的ACC 在Ad-apoptin 誘導的細胞凋亡中的關鍵作用，從另一層面揭示癌癥治療中脂代謝和細胞凋亡之間的關系（圖4），與GAO 等［2］發現上調AMPK/ACC可降低胰腺癌脂代謝和誘導凋亡的研究結果一致。本次研究還發現Ad-apoptin 的治療在裸鼠移植瘤中也取得預期的效果。

脂代謝參與許多細胞過程的調節，脂代謝紊亂在病理上與癌癥有關［17］。ACC 作為脂肪酸合成的限速酶，在癌細胞的生長和存活中起著關鍵作用［18］。AMPK 的磷酸化將ACC 轉化為非活性形式，導致脂代謝降低。在本研究中，探討了Ad-apoptin可能通過激活肺癌細胞中的AMPK信號來提高ACC磷酸化水平。本課題組還發現敲低AMPK 基因或ACC 的失活可以減弱Ad-apoptin 誘導的細胞凋亡，提示AMPK/ACC 信號通路參與細胞凋亡。雖然肺癌細胞株和移植瘤裸鼠的研究結果足以證明AMPK-ACC 信號在Ad-apoptin 治療中的作用和重要性，但目前的研究沒有在臨床上得以證實，無法確定這一分子機制是否與Ad-apoptin 在臨床癌癥模型中的治療結果一致。

綜上所述，研究結果探索了Ad-apoptin 靶向AMPK，在AMPK/ACC 信號通路中參與細胞凋亡的關鍵作用，并為腫瘤脂代謝和細胞凋亡之間的相互作用提供了新的見解。