CCL15在膿毒癥免疫病理過程中的作用及機制研究①

黃麗莉 李佳熹 黃 俊 余仁琳 曹 炬（重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科，重慶 400016）

根據膿毒癥3.0 的定義，膿毒癥是由于宿主對感染反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙［1］。膿毒癥對人們的生命健康造成極大威脅，雖然近年來膿毒癥在診斷及治療方面都取得了明顯進展，但迄今為止，它仍是ICU死亡的主要原因。當膿毒癥伴隨休克發生時，病死率可以達到40%～50%［2］。膿毒癥發病機制尚未明了，且無較好治療方案和診斷標志物［3］。膿毒癥主要由機體免疫功能紊亂所致，在此過程中有大量細胞因子參與，促炎因子大量釋放的同時伴有抑炎因子的合成與釋放，與后期發展成免疫失衡密切相關［4］。因此，探尋細胞因子在膿毒癥中的調控作用有助于明確膿毒癥發生機制。CCL15（CC motif chemokine ligand 15）是一種重要的趨化因子，通過與CCR1和CCR3結合對免疫細胞發揮生物學活性，它對大多外周血白細胞亞群都有強吸引力［5］。有研究報道CCL15參與慢性肺炎、結直腸癌的疾病進程，體現了CCL15 在癌癥轉移和炎癥反應中的作用，但關于CCL15 在膿毒癥中的作用尚不清楚［6-7］。本研究發現CCL15 在膿毒癥患者中的表達水平顯著升高，表明CCL15 參與膿毒癥的疾病進程，進一步探究其參與膿毒癥免疫調控的機制，有望為膿毒癥的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用6～8 周雄性C57BL/6 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證號：110322220100267963），飼養于重慶醫科大學SPF 級實驗動物中心，所有動物實驗操作嚴格遵守動物中心的要求，并經重慶醫科大學倫理委員會論證通過。

1.1.2 實驗材料、試劑 根據膿毒癥3.0 的定義，納入重慶醫科大學第一附屬醫院的30 例膿毒癥成人患者以及重慶醫科大學第一附屬醫院體檢中心收治30 例年齡和性別匹配的健康成人對照樣本。記錄患者及健康對照者的臨床資料，包括序貫器官衰竭評估（SOFA）評分、白細胞（WBC）計數、降鈣素原（PCT）、C 反應蛋白（CRP）、血小板（PLT）水平、年齡等（表1）。惡性腫瘤患者、器官移植患者、艾滋病毒感染者和在過去8周內接受免疫抑制治療的患者被排除在研究之外。本方案經重慶醫科大學臨床研究倫理委員會批準。

表1 膿毒癥患者及健康對照者臨床資料Tab.1 Baseline characteristics of patients with sepsis and healthy controls

哥倫比亞血瓊脂平板購自安圖生物；ELISA 試劑盒購自Sigma 公司，人重組CCL15 蛋白（recombinant human CCL15 protein）購自R&D Systems；Alexa 647 標記的CD11b 抗體、PE 標記的F4/80 抗體及同型對照抗體購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立與分組 將小鼠隨機分為3 組，每組10 只，即假手術組（Sham）、對照組（CLP+PBS）、蛋白組（CLP+CCL15）。采用盲腸結扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）模型建立膿毒癥的動物模型［8］。在CLP 模型中，通過對小鼠進行盲腸結扎穿刺，造成內源性腹部感染，隨后細菌進入血液腔室，引發全身炎癥反應。麻醉小鼠并暴露盲腸，用縫合線進行結扎，再用穿刺針刺穿盲腸，隨后對腹部切口進行縫合。Sham 組小鼠接受麻醉，暴露盲腸，但不進行結扎或穿刺，隨后將盲腸放回腹膜腔。在補充重組蛋白時，小鼠CLP 術后立即注射人CCL15重組蛋白，對照組小鼠進行同樣操作，并注射等量含0.1%BSA的PBS。

1.2.2 ELISA 檢測血清CCL15 水平 取膿毒癥患者、健康體檢者外周血，離心后取血清凍存于-80℃冰箱中。取膿毒癥小鼠或對照組小鼠心臟血，離心后取血清凍存于-80℃。實驗步驟嚴格按照ELISA試劑說明書進行。

1.2.3 血液生化 心臟穿刺后用肝素抗凝EP管收集小鼠血液，離心后取上清。檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、和肌酐（CREA）等指標。

1.2.4 細菌載量試驗 在CLP 后的24 h 處理小鼠，在無菌條件下收集心臟血。梯度稀釋10 倍及100 倍，無菌涂布于血瓊脂平板，37℃孵育過夜，計菌落數量。

1.2.5 組織病理 取小鼠肺臟、肝臟，浸泡于4%多聚甲醛中，4℃固定24～48 h。之后依次進行洗滌、脫水、透明、浸蠟，然后進行包埋和切片。將石蠟切片于二甲苯中脫蠟，于梯度濃度的乙醇中進行水化。蘇木精染色后，用自來水沖洗后在1%鹽酸乙醇中分化10 s。在飽和碳酸鋰溶液中處理后在蒸餾水中靜置數分鐘，用伊紅染色2 min。漂洗后用梯度乙醇脫水2 min，轉移入二甲苯中透明處理10 min，最后用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

1.2.6 腹腔灌洗液（peritoneal lavage fluide，PLF）總白細胞計數 取小鼠PLF，4℃離心后棄上清。加入500μl紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，裂解3 min后再次離心棄去上清。加入1 ml PBS 再次重懸細胞沉淀，用牛鮑計數板計數總白細胞數，剩余細胞可用于流式檢測。

1.2.7 流式抗體染色 取PLF 細胞沉淀加入紅細胞裂解液裂解3 min，離心后去上清。用已預冷處理的無菌PBS 洗滌2 次。向每管內加入2 μl CD16/32抗體，充分混勻后轉移至4℃冰箱內，避光封閉15 min。分別向EP 管內加入1μl 待染色細胞的特異性熒光標記抗體（Alexa 647-CD11b、PE-F4/80）或者其同型對照抗體，4℃避光孵育30 min。用PBS洗滌細胞后進行離心重懸，送檢。

1.2.8 細菌吞噬和殺傷試驗 小鼠腹腔注射液體石蠟，以募集巨噬細胞。5～7 d 后將小鼠斷頸，于無菌環境下抽取腹腔灌洗液，獲得原代腹腔巨噬細胞，待細胞穩定之后分別加入蛋白或者PBS 刺激過夜。以MOI 100 加入銅綠假單胞菌在37℃下感染巨噬細胞30 min，用含有妥布霉素的緩沖液去除胞外細菌。加入200μl 無菌雙蒸水，室溫裂解細胞約20 min以評估吞噬能力（t=0 h），或孵育2 h（t=2 h）以評估細菌殺傷能力。將稀釋后的裂解液均勻鋪于血平板，置于37℃孵箱內培養16～20 h，計數菌落數量。

1.3 統計學處理 所有數據的統計分析和作圖均使用GraphPad Prism 5.01 軟件進行。采用Mann-WhitneyU檢驗分析組間差異；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并采用對數秩檢驗進行生存曲線分析，比較生存率差異。P＜0.05 表示差異有統計學意義。所有實驗均重復2次。

2 結果

2.1 CCL15 在膿毒癥患者和膿毒癥小鼠中表達升高 ELISA 檢測膿毒癥患者和健康體檢者血清CCL15 的含量，膿毒患者血清中CCL15 表達明顯高于健康對照組（P＜0.000 1，圖1A）。隨后血清濃度下降，但仍然顯著高于對照組（P＜0.000 1，圖1B）。通過CLP 建立小鼠膿毒癥模型，取小鼠心臟血，ELISA 檢測CCL15 水平。結果顯示，膿毒癥小鼠CCL15水平較Sham組小鼠顯著升高（P＜0.01，圖1C）。

圖1 膿毒癥患者和膿毒癥小鼠ELISA檢測結果Fig.1 ELISA results of septic patients and septic mice

2.2 CCL15 顯著改善膿毒癥小鼠生存率 在實驗動物模型中，通過注射人CCL15 重組蛋白，進一步探究CCL15 在膿毒癥中的作用。其中，實驗組和CLP+PBS 組小鼠均通過CLP 方法構建膿毒癥的動物模型，并分別注射CCL15 重組蛋白（0.5μg/只）和含0.1%BSA 的PBS。Sham 組對小鼠進行腹腔的剪開、縫合。在建模后14 d 內每天觀察小鼠的生存情況。觀察發現，在補充CCL15 重組蛋白之后，膿毒癥小鼠的生存率較CLP+PBS 顯著提高（P＜0.01，圖2）。結果表明，CCL15可以改善膿毒癥生存率。

圖2 補充重組CCL15蛋白改善膿毒癥小鼠生存率Fig.2 Supplementation with recombinant CCL15 protein improved survival rate of sepsis mice

2.3 CCL15 改善膿毒癥小鼠病理損傷 膿毒癥往往導致多器官損傷，進一步研究了CCL15 對于膿毒癥小鼠器官損傷的影響。生化結果顯示，蛋白處理組ALT、LDH、CREA 等生化損傷相關指標較PBS 處理組顯著降低（P＜0.05，圖3）。HE 染色也顯示CCL15處理改善了膿毒癥小鼠的器官損傷情況。對照組小鼠的肝組織中局部可見較大量的肝細胞壞死，核碎裂或溶解，局部可見肝細胞水腫（圖4A）；肺組織中較多肺泡壁增厚，伴有較多淋巴細胞與中性粒細胞浸潤（圖4B）。CCL15 處理組的炎癥浸潤、充血水腫均有改善。

圖3 CCL15對膿毒癥小鼠生化指標的影響Fig.3 Effects of CCL15 on biochemical indexes of septic mice

圖4 CCL15 對膿毒癥誘導的小鼠組織病理學改變的影響（×200）Fig.4 Effects of CCL15 to histopathological changes in septic mice（×200）

2.4 CCL15 處理促進膿毒癥小鼠細菌清除 膿毒癥與感染密切相關，為進一步探索CCL15 對于膿毒癥小鼠體內細菌清除的影響，于CLP 術后24 h 取小鼠心臟血進行細菌載量實驗。相較于CLP+PBS 組，CLP+CCL15 組的小鼠血液中的細菌載量顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01，圖5）。

圖5 細菌載量Fig.5 Bacterial counts

2.5 CCL15處理促進小鼠PLF免疫細胞聚集 CLP建模后24 h 的膿毒癥小鼠腹腔灌洗液，計細胞總數，通過流式細胞術染色計數巨噬細胞（CD11b+F4/80+）百分比。經重組CCL15 蛋白處理后，膿毒癥小鼠PLF 中白細胞總數較PBS 處理的CLP+PBS 組顯著增加（P＜0.05，圖6），提示白細胞募集顯著增多。相較于CLP+PBS 組，CLP+CCL15 組小鼠PLF 中巨噬細胞比例增加，巨噬細胞數量顯著增多（P＜0.05，圖6）。

圖6 CLP術后小鼠PLF中白細胞浸潤情況Fig.6 Leukocytes recruitment in PLF after CLP

2.6 CCL15 處理對巨噬細胞吞噬殺傷的影響 進一步通過體外實驗探究CCL15 是否影響巨噬細胞抗菌功能。分別用重組人CCL15蛋白和PBS刺激巨噬細胞，再用銅綠假單胞菌感染巨噬細胞，結果顯示，經CCL15 蛋白刺激后，巨噬細胞的吞噬殺傷能力高于PBS 對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05，圖7）。

圖7 CCL15對巨噬細胞殺傷的影響Fig.7 Effects of CCL15 on bacterial phagocytosis and killing by macrophages

3 討論

膿毒癥在任何年齡、任何基礎疾病背景下均可發生，尤其是在并發膿毒癥休克后更加危險，病死率極高［9］。有研究報道，膿毒癥是重型及危重型新冠肺炎患者最常見的并發癥，重癥患者多在1 周后出現膿毒癥、膿毒性休克，膿毒癥在新冠肺炎非幸存組的發生率甚至達到100%［10-11］。膿毒癥目前仍缺乏有效的治療藥物和高效診斷標志物，對于膿毒癥的認識還需要更多的研究。CCL15 又名Lkn-1、HCC-2、NCC-3，其mRNA在肝、腸、肺中高度表達［12-13］。本研究首次闡明CCL15 在膿毒癥中表達量顯著增高，發揮免疫保護作用，改善膿毒癥小鼠生存情況。

過去的研究顯示，CCL15 表達在慢性過敏性肺炎、哮喘、肝癌等疾病中升高，體現了CCL15 在癌癥轉移和炎癥反應中的作用［6，14-15］。通過ELISA 檢測發現，膿毒癥患者和膿毒癥小鼠的CCL15 含量同樣顯著升高，提示CCL15 參與膿毒癥免疫病理，且對膿毒癥診斷具有潛在價值。鑒于CCL15 表達水平在膿毒癥患者和膿毒癥小鼠中均顯著升高，為了進一步驗證CCL15 在膿毒癥中發揮的作用，通過給小鼠注射補充人CCL15 重組蛋白，評價其對生存率的影響。有研究表明C-X-C 亞族（α 亞族）趨化因子受體抑制可在一定時間范圍內提高膿毒癥患者的生存率，體現了α 趨化因子在膿毒癥中的潛在免疫損害作用［16］。CCL15 作為β 亞族趨化因子的成員，本研究中通過注射CCL15 的重組蛋白，卻顯著提高了膿毒癥小鼠的生存率。進一步，在實驗性膿毒癥中發現，注射CCL15 蛋白可以改善小鼠器官損傷，促進細菌清除，從而發揮保護作用并提高膿毒癥小鼠的生存率。吞噬細胞是膿毒癥發生發展過程中的關鍵細胞，在感染控制中發揮重要作用。有研究表明，IL-34在膿毒癥期間可以通過調控巨噬細胞的募集來改善生存率［17］。顆粒蛋白前體（progranulin）通過促進腹腔巨噬細胞的募集在膿毒癥中發揮保護作用［18］。這與本研究的結果一致，CCL15 可以促進膿毒癥小鼠PLF 中的巨噬細胞聚集，它在膿毒癥中的免疫保護作用可能是通過巨噬細胞來介導的。CCL15 在人骨肉瘤細胞中可以激活NF-κB，而NFκB 是調節激活巨噬細胞的關鍵轉錄因子［19-21］。也有研究表明，長鏈非編碼RNA NEAT1 調控NF-κB通路，在膿毒癥誘導的急性腎損傷中發揮重要作用［22］。通過體外實驗發現，CCL15 蛋白處理可以在一定程度上促進巨噬細胞對細菌的吞噬殺傷，但沒有顯著差異。綜上所述，盡管對巨噬細胞的吞噬殺傷能力影響不大，CCL15 可通過顯著增加吞噬細胞數量來促進細菌清除。關于CCL15 在膿毒癥中如何參與疾病進程，其更加深入的分子機制需更進一步的研究。

綜上所述，CCL15 在膿毒癥中發揮免疫保護作用，通過促進巨噬細胞聚集，促進細菌清除，改善病理損傷，改善膿毒癥小鼠生存率。以上結果為進一步探究膿毒癥的發病機制和治療方法奠定了基礎。