IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性①

劉 倩 李亞梅 陳麗娜 李 靜 裴建贏 王燕俠 毛寶宏（甘肅省婦幼保健院科研中心，蘭州 730050）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥，其病因復(fù)雜，年齡、生活方式、遺傳、內(nèi)分泌、解剖和免疫等多種因素均與其發(fā)病有關(guān)［1］。研究發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎細(xì)胞因子之間的生理平衡對(duì)胚胎著床和維持妊娠至關(guān)重要［2］。促炎細(xì)胞因子包括Th1 型細(xì)胞因子（如IFN-γ 和TNF-α）和其他細(xì)胞因子（如IL-1β和IL-6），而抗炎細(xì)胞因子是Th2 型的細(xì)胞因子（如IL-4 和IL-10）和其他細(xì)胞因子（如TGF-β1）［3］。IL-4可促進(jìn)Th細(xì)胞分化為Th2效應(yīng)細(xì)胞，并通過(guò)與其受體IL-4Ra 結(jié)合激活信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗炎作用［4］。既往研究關(guān)于IL-4基因多態(tài)性和RSA 的相關(guān)性結(jié)果并不一致［5-6］，且IL-4R 基因多態(tài)性和RSA 的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為進(jìn)一步明確這兩個(gè)基因多態(tài)性與RSA 的關(guān)系，本研究應(yīng)用SNaPshot 技術(shù)對(duì)IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性進(jìn)行分型，評(píng)估其對(duì)RSA 發(fā)病的影響，以期為臨床診斷RSA提供早期分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 患者信 息 RSA 組：選取2019 年1 月至2020 年8 月就診于甘肅省婦幼保健院RSA 門診的至少有過(guò)3 次流產(chǎn)的婦女150 例作為RSA 組，RSA的診斷根據(jù)2016年我國(guó)“復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識(shí)”標(biāo)準(zhǔn)［7］。診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠28 周前發(fā)生自然流產(chǎn)至少3 次；②夫婦雙方不存在異常染色體核型；③無(wú)生殖器解剖學(xué)畸形；④內(nèi)分泌功能正常；⑤無(wú)血栓前狀態(tài)、低纖維蛋白血癥及血小板增多癥；⑥ACA、β2 球蛋白、抗甲狀腺抗體等自身抗體陰性；⑦排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等傳染性疾??；⑧排除宮外孕、生化妊娠、計(jì)劃流產(chǎn)、意外流產(chǎn)等妊娠史。健康對(duì)照組：選取與RSA 組同一時(shí)段于甘肅省婦幼保健院健康管理中心進(jìn)行體檢的女性健康志愿者150 例作為對(duì)照組。診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往無(wú)自然流產(chǎn)、宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩及胎兒先天缺陷等不良孕產(chǎn)史；②至少有過(guò)1次正常生育史；③排除高血壓、糖尿病、肝腎、內(nèi)分泌、免疫異常等全身性或基礎(chǔ)性疾病。所有研究對(duì)象均閱讀并簽署知情同意書(shū)。本課題經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合《赫爾辛基宣言》。

1.1.2 試劑與儀器 人類基因組DNA 提取試劑盒（中國(guó)北京天根生化科技有限公司）；GC-Ⅰbuffer（TaKaRa）；HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.）；蝦堿酶（Promega）；外切酶Ⅰ（Epicentre）；SNaPshot Multiplex Kit（ABI）；FR-110 紫外分析儀、FR-250 電泳儀（上海復(fù)日科技有限公司）；凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）；2720 Thermal Cycler 擴(kuò)增儀、3730xl genetic analyzer分析儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對(duì)象空腹12 h 后于次日清晨采集外周血3 ml于EDTA-K2抗凝管并分裝凍存于-80℃冰箱。同時(shí)收集并記錄患者的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、焦慮自評(píng)量表（self-rating anxiety scale，SAS）和抑郁自評(píng)量表（selfrating depression scale，SDS）評(píng)分等一般資料。

1.2.2 DNA 提取 取出之前分裝保存的EDTA 抗凝劑全血，全基因組DNA 的提取根據(jù)DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度和純度，DNA 濃度＞20 ng/μl，A260/A280≈1.8，A260/A230＞2.0，則DNA 提取成功，可以繼續(xù)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 基因分型 本實(shí)驗(yàn)利用SNaPshot SNP 分型技術(shù)進(jìn)行分型。引物用在線Primer3 軟件設(shè)計(jì)（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及長(zhǎng)度見(jiàn)表1。采用20 μl PCR 擴(kuò)增體系：去離子水5 μl，2×GC-Ⅰbuffer 10μl，3.0 mmol/L Mg2+0.4μl，0.3 mmol/L dNTP 2.4 μl，1 U HotStarTaq polymerase 0.2 μl，樣本DNA 1μl 和多重PCR 引物1μl。擴(kuò)增程序如下：95℃2 min；94℃20 s，65℃（-0.5℃/循環(huán)）40 s，72℃1.5 min，11 個(gè)循環(huán)；94℃20 s，59℃30 s，72℃2 min，24個(gè)循環(huán)；72℃2 min。將5 U蝦堿酶和2 U外切酶Ⅰ加入10 μl PCR 產(chǎn)物中，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min 進(jìn)行純化。之后進(jìn)行SNaPshot 多重單堿基延伸反應(yīng)，體系（10 μl）包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit，2 μl 純化后的多重PCR 產(chǎn)物，1 μl 延伸引物混合物，2μl 超純水。程序如下：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，28 個(gè)循環(huán)。然后在10μl延伸產(chǎn)物中加入1 U 蝦堿酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min 進(jìn)行純化。最后取0.5 μl 純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μl LIZ 120 Size Standard 和9 μl Hi-Di 混勻，95℃變性5 min后上3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1分析。

表1 IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 引物序列和PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences and length of PCR products of IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg（HWE）平衡檢驗(yàn)，P＞0.05 表示符合HWE 平衡檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間基因型和基因頻率對(duì)比（顯著性水平α=0.05），基因型與RSA 的相關(guān)性采用優(yōu)勢(shì)比（odd ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS26.0軟件進(jìn)行，Logistic二元逐步回歸進(jìn)行多因素分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSA 組和正常對(duì)照組基本信息 RSA 組和正常對(duì)照組間年齡、BMI、民族、吸煙史、飲酒史、SAS和SDS 積分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組間的居住地和家庭收入比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 RSA組和對(duì)照組女性人口學(xué)和臨床特征Tab.2 Demographic and clinical characteristics of RSA group and control group

2.2 IL-4 基 因rs2243250 和IL-4R 基 因rs1805010在RSA 與對(duì)照人群基因多態(tài)性分析 對(duì)照組人群IL-4 基因rs2243250 和IL-4R 基因rs1805010 位點(diǎn)符合HWE 平衡分析（P均＞0.05）。RSA 組人群IL-4 基因rs2243250 位點(diǎn)TT 基因型分布頻率為58.7%，TC基因型為35.3%，CC 基因型為6.0%，對(duì)照組人群中rs2243250 位點(diǎn)TT 基因型分布頻率為60.0%，TC 基因型為35.3%，CC 基因型為4.7%。對(duì)IL-4 基因rs2243250 位點(diǎn)在RSA 和對(duì)照組人群中的基因型分布進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.87），見(jiàn)表3。

RSA 組人群IL-4R 基因rs1805010 位點(diǎn)GG 基因型分布頻率為34.7%，GA 基因型為42%，AA 基因型為23.3%，對(duì)照組人群中rs1805010 位點(diǎn)GG 基因型分布頻率為21.3%，GA 基因型為52%，AA 基因型為26.7%。對(duì)IL-4R 基因rs1805010 位點(diǎn)在RSA 和對(duì)照組人群中的基因型分布進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04）。攜帶有GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低（OR=0.50，95%CI=0.29～0.86），經(jīng)校正年齡、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回歸分析顯示攜帶有GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍降低（OR=0.55，95%CI=0.30～0.99），見(jiàn)表3。

表3 IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性和RSA發(fā)病的相關(guān)性Tab.3 Association between IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010 gene polymorphisms and risk of RSA

2.3 不同遺傳模式下IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性和RSA 發(fā)病的相關(guān)性 在等位基因遺傳模式下，RSA 組和對(duì)照組IL-4R rs1805010 位點(diǎn)A 等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041），攜帶有A 等位基因的人群RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低于G 等位基因（OR=0.71，95%CI=0.52～0.99），經(jīng)校正年齡、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回歸分析顯示攜帶有A 等位基因的人群RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍降低（OR=0.71，95%CI=0.51～0.99）。同時(shí)在顯性遺傳模式下，RSA 組和對(duì)照組IL-4R rs1805010位點(diǎn)AA+GA 基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），攜帶有AA 和GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低于GG 基因型（OR=0.51，95%CI=0.31～0.86），經(jīng)校正年齡、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回歸分析顯示攜帶有AA 和GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍降低（OR=0.49，95%CI=0.29～0.85），見(jiàn)表4。

表4 不同遺傳模式下IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性和RSA發(fā)病的相關(guān)性Tab.4 Association between IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010 gene polymorphisms and risk of RSA under different inheritance models

3 討論

RSA 不僅會(huì)給孕婦和家庭造成極大的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)還會(huì)影響后期的妊娠結(jié)局。近年來(lái)免疫失調(diào)被認(rèn)為是導(dǎo)致RSA 的潛在機(jī)制，正常妊娠過(guò)程傾向于Th2 型免疫反應(yīng)，而有RSA 病史的女性傾向于Th1 型免疫反應(yīng)［8］。Th1 型免疫反應(yīng)是早期著床需要的，而妊娠的維持依賴于Th2 型抗炎細(xì)胞因子或Treg［9］。IL-4作為Th2型抗炎細(xì)胞因子，對(duì)Th1 型細(xì)胞因子發(fā)揮拮抗作用，可通過(guò)與其受體IL-4Ra 結(jié)合促進(jìn)胚胎發(fā)育和胎盤形成，對(duì)妊娠成功起重要作用［10］。單核苷酸多態(tài)性可能通過(guò)改變基因的功能或轉(zhuǎn)錄活性從而影響蛋白的活性或表達(dá)，因此本研究探討IL-4 和IL-4R 基因多態(tài)性與RSA 發(fā)病間的相關(guān)性，以期為臨床從分子學(xué)水平診斷RSA提供參考。

本研究人口學(xué)和臨床資料統(tǒng)計(jì)顯示居住地和家庭月收入在RSA 和健康志愿者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。居住地對(duì)RSA 妊娠結(jié)局的影響可能主要與居住環(huán)境因素有關(guān)，有研究顯示，居住環(huán)境有噪音和難聞性氣味均是發(fā)生RSA 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［11］。BRUCKNER 等［12］報(bào)道低收入女性群體相較于高收入群體其焦慮和抑郁程度更高，不良心理狀態(tài)可作用于神經(jīng)系統(tǒng)，使交感神經(jīng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸調(diào)節(jié)途徑異常，進(jìn)而經(jīng)雙向調(diào)節(jié)影響機(jī)體的免疫功能［13］。關(guān)于居住地和家庭月收入對(duì)RSA 的影響還需進(jìn)一步研究，同時(shí)本研究納入的環(huán)境和社會(huì)危險(xiǎn)因素有限，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)RSA 風(fēng)險(xiǎn)因素篩查，并對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素提前進(jìn)行預(yù)防和控制，從而提高RSA患者的妊娠成功率。

同時(shí)本研究顯示IL-4 rs2243250 基因多態(tài)性與RSA發(fā)病不相關(guān)，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于IL-4 rs2243250多態(tài)性與RSA 相關(guān)性的文章尚未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外ESKANDAR團(tuán)隊(duì)運(yùn)用等位基因特異性寡核苷酸雜交法PCR（ASO-PCR）技術(shù)行基因分型，分析伊朗婦女人群IL-4 rs2243250多態(tài)性與RSA發(fā)病的相關(guān)性，結(jié)果顯示IL-4 rs2243250多態(tài)性與RSA 不相關(guān)［5］，與本研究一致。另外PARVEEN 等［6］運(yùn)用同樣的ASO-PCR 技術(shù)對(duì)北印度婦女人群IL-4 rs2243250 多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)在顯性和等位基因模式下差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T 等位基因和TT、TC 基因型是發(fā)生RSA 的危險(xiǎn)因素。國(guó)外這兩個(gè)研究采用同種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行基因分型，結(jié)果的差異可能主要由納入的人群種族不同所造成。

關(guān)于IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性的研究，近年來(lái)主要集中在過(guò)敏性相關(guān)疾病，如哮喘和腎移植后急性排斥反應(yīng)等，也見(jiàn)于宮頸上皮內(nèi)病變與宮頸癌［14-16］，但關(guān)于IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性和RSA的相關(guān)性目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)目首次對(duì)IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性和RSA 的相關(guān)性研究顯示，A等位基因和AA、GA 基因可能是發(fā)生RSA 的保護(hù)因素，臨床應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注攜帶IL-4R rs1805010 位點(diǎn)G 等位基因和GG 基因型的婦女，其RSA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)增高。關(guān)于IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性與RSA 的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，IL-4R 是一種由兩個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)，即α鏈和γc 鏈。α鏈從IL-4 信號(hào)轉(zhuǎn)移而來(lái)，隨后被γc 鏈放大［17］。IL-4R rs1805010基因多態(tài)性位于α鏈的編碼區(qū)，研究表明，這種多態(tài)性變異可影響IL-4R 受體對(duì)IL-4 的敏感性增強(qiáng)，這種增強(qiáng)的IL-4 信號(hào)持續(xù)促進(jìn)磷酸化，會(huì)使STAT6轉(zhuǎn)錄因子異常激活，導(dǎo)致Th2 細(xì)胞分化增加［18-19］。Th1/Th2 分化失衡可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌異常，進(jìn)而在RSA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示環(huán)境因素居住地和家庭月收入是RSA 的風(fēng)險(xiǎn)因素，IL-4R rs1805010 位點(diǎn)A 等位基因和AA、GA 基因型可能是RSA 發(fā)病的保護(hù)因素，IL-4 rs2243250 基因多態(tài)性與RSA 無(wú)相關(guān)性。IL-4 及其受體IL-4R 與RSA 相互作用機(jī)制及環(huán)境因素和基因的交互作用還有待進(jìn)一步研究。