MNV感染對乙肝疫苗效價評價的影響*

李曉波 王淑菁 付 瑞 王莎莎 秦 驍 李 威 黃宗文 賀爭鳴 王 吉 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

實驗動物是生命科學研究的基礎，廣泛應用于生物、醫藥、化工、農業、畜牧等領域，實驗動物質量會直接影響到科學實驗結果的可靠性和準確性，關系著產品質量和人民群眾的身體健康。生物制品質量問題牽扯著人民大眾的神經，是關系國計民生的大事，關乎國家的長治久安，而生物制品質量評價需要大量的動物實驗，因此必須重視實驗動物的質量問題，實驗動物微生物的預防與控制就顯得尤為緊迫和重要。

小鼠諾如病毒(murine norovirus,MNV)是目前實驗小鼠中感染率最高的病毒[1-2]，國際上一些知名的實驗動物監管和檢測機構如歐洲實驗動物聯合會(FELASA)[3]、Charles River實驗室等已將其列為實驗小鼠的常規檢測項目，盡管我國已出臺了MNV的團體標準，但不具有強制性，而實驗動物國家標準目前還未要求實驗小鼠排除MNV，因此我國大多數的實驗動物生產和使用單位都未對其進行控制，因此，造成很多實驗使用的小鼠是MNV陽性鼠。

已有報道MNV對巨噬細胞和樹突狀細胞具有感染親嗜性，并能夠感染B細胞[4-5]，感染免疫細胞的特性表明MNV可能會對免疫相關的實驗造成影響。小鼠可通過發揮固有免疫及適應性免疫功能抗MNV感染，根據李曉波[6]研究表明MNV感染會影響小鼠的免疫應答，導致T細胞、B細胞含量及細胞因子含量發生顯著改變。因此，MNV的感染極有可能會影響生物制品的質量評價，而目前這方面的研究尚處于空白。

乙肝疫苗為國家計劃內疫苗(一類疫苗)，其質量把控至關重要，乙肝疫苗的檢驗依據《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版第三部進行，其中規定用NIH或BALB/c小鼠來測定重組乙肝疫苗(CHO細胞)的效價，本研究參照《中國藥典》乙肝疫苗效價測定方法，選用BALB/c小鼠為實驗對象，研究MNV的感染對乙肝疫苗效價測定的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1病毒株:小鼠諾如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，本實驗室分離并保存[7]，TCID50為10-5.330/0.1 mL。

1.1.2實驗動物:SPF級BALB/c小鼠，體質量8～10 g，雌性，共120只，購自國家嚙齒類實驗動物種子中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2017-0005，經檢測符合SPF等級實驗動物國家標準且MNV為陰性。動物實驗于中國食品藥品檢定研究院屏障動物設施進行，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0013，實驗所用鼠料、水、墊料等均經滅菌處理，已通過中檢院實驗動物福利倫理審查委員會審查，中檢動(福)第2018(B)020號，按實驗動物的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑和儀器

重組乙型肝炎疫苗(CHO細胞，規格：20 μg/支，批號：201707YB06)為華北制藥金坦生物技術股份有限公司生產；乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒(規格：96人份，批號：201709181)購自上海科華生物工程股份有限公司。酶標儀(Thermo，型號MK3)。

1.3 方法

1.3.1動物分組：動物隨機分為感染組和對照組，每組60只，感染組經口灌胃0.2 mL MNV病毒液，對照組灌胃0.2 mL生理鹽水。

1.3.2乙肝疫苗的免疫：小鼠感染MNV后第7天免疫乙肝疫苗，感染組和對照組均分為乙肝疫苗高劑量組(1.25 μg/mL)、中劑量組(0.31 μg/mL)和低劑量組(0.078 μg/mL)，每組20只，每只腹腔注射乙肝疫苗1 mL。于免疫后第7、14、21、28及35天分別經眼周靜脈采血，分離血清。

1.3.3乙肝表面抗體(HbsAb)的檢測：用乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒定性檢測HbsAb，按說明書操作進行，每份樣本測兩次。

1.3.4結果的計算與分析：①計算半數動物有效劑量(ED50)：分別計算感染組和對照組各免疫時間點的ED50值，具體為統計各劑量組乙肝疫苗免疫后HbsAb陰陽性動物數量，計算距離比例=高于50%陽轉率-50/高于50%陽轉率- 低于50%陽轉率，計算50%陽轉終點對數=高于50%陽轉率稀釋對數+距離比例×稀釋對數的因數，計算稀釋度=1050%陽轉終點對數，計算ED50=原濃度(20 μg/ml)/稀釋度；②統計分析：采用SPSS19.0軟件進行分析，t檢驗比較對照組與感染組總體ED50均值；卡方檢驗比較對照組與感染組總體HbsAb結果及各時間點、各劑量組的HbsAb結果，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 ED50比較

由于免疫第7天HbsAb陽轉率較低，無法計算其ED50。比較對照組和感染組各時間點ED50的總體均值，結果無統計學差異(P>0.05)；對比兩組各時間點的ED50值可見，除了免疫后第21天兩組的值接近，其余3個時間點感染組的ED50值均高于對照組(表1)。

表1 對照組及感染組ED50值比較(μg/mL)

2.2 HbsAb陽性率比較

2.2.1總體陽性率比較:對照組與感染組各免疫時間點HbsAb總體陰陽性結果見表2，經卡方檢驗，兩組HbsAb陽性率無統計學差異(P>0.05)。

表2 對照組及感染組總體HbsAb結果比較

2.2.2各時間點兩組HbsAb陽性率比較：分別比較免疫后各時間點兩組之間HbsAb陽性率，經卡方檢驗，免疫乙肝疫苗后第7、14、21、28、35天感染組和對照組HbsAb陽性率均無統計學差異(P>0.05，表3)。

表3 不同時間點對照組及感染組HbsAb結果比較

2.2.3不同劑量組兩組小鼠HbsAb陽性率比較:由于低劑量組HbsAb結果均為陰性，未對其進行統計學比較。經卡方檢驗，乙肝疫苗免疫后第28天及第35天，對照組小鼠免疫高劑量乙肝疫苗產生HbsAb的動物數量顯著高于感染組(MNV陽性組)(P<0.05)；疫苗免疫后第14天，對照組小鼠免疫中劑量乙肝疫苗產生HbsAb的動物數量相比感染組(MNV陽性組)有顯著提高(P<0.05)，其余各時間點未見統計學差異(表4)。

表4 各免疫劑量組內對照組及感染組HbsAb比較

3 討論

《中國藥典》2015年版第三部規定乙肝疫苗接種4～6周后采血，測定乙肝表面抗體，本實驗選擇在乙肝疫苗接種后第1～5周共5個時間點采血，對每個時間點的免疫效果分別進行比較，以更全面的評估MNV感染對乙肝疫苗效價測定的影響。實驗的設計遵循實驗動物福利的3R原則，使用盡量少的動物得到所需要的數據，每個劑量免疫20只，對小鼠進行少量多次采血，每次采血控制在小鼠循環血量的10%以內，大約100～200 μL，對動物的損傷較輕，并且保證了結果的準確性。對結果進行“定量”和“定性”的比較，“定量”指比較ED50，“定性”比較HbsAb的陰陽性結果。

從已有研究來看，目前還未有MNV的不同感染劑量會影響實驗結果的報道。參考文獻報道的方法[8-9]，本研究采用經口灌胃的方式和單一的攻毒劑量感染小鼠，但病毒的感染劑量仍是影響實驗結果不可忽視的因素，針對MNV的不同感染劑量對乙肝疫苗質量評價結果影響的問題，還需后續的實驗進行深入研究。按照《中國藥典》2015年版第三部中規定的乙肝疫苗效價測定方法，需將乙肝疫苗濃度設為高、中、低3個劑量組來免疫小鼠，再根據每個劑量組的免疫結果來計算疫苗的半數動物有效劑量(ED50)。本研究在實驗的每個時間節點均通過采集糞便的方式對小鼠的MNV進行監測，結果顯示整個實驗周期感染組小鼠MNV均為陽性，對照組均為陰性，確保了實驗結果的準確性。

MNV感染對生物制品檢定的影響，目前國內外均無相關的報道。盡管比較對照組和感染組所有時間點ED50的總體均值、兩組HbsAb的總體陽性率及每個時間點HbsAb的陽性率，均未發現存在顯著差異，但進一步比較各劑量組的結果，發現在免疫第14天，中劑量乙肝疫苗免疫對照組小鼠產生HbsAb的動物數量顯著高于感染組；免疫第28天及第35天，高劑量疫苗免疫對照組小鼠產生HbsAb的動物數量均顯著高于感染組。各時間點的ED50值相比，除了免疫第21天，其余時間點的ED50值對照組均低于感染組。藥典規定的采血時間點是免疫后第28天～第42天，而實驗結果表明這段時間兩組的結果會出現差異。以上結果表明使用MNV感染的小鼠來評價乙肝疫苗會導致實驗結果出現偏差，所測的乙肝疫苗效價有可能低于MNV陰性小鼠。

MNV對巨噬細胞和樹突狀細胞具有感染親嗜性[4-5]，而巨噬細胞和樹突狀細胞在動物機體的免疫應答過程發揮著十分重要的作用，樹突狀細胞負責抗原遞呈和加工，可促進T細胞活化，還可誘導T細胞產生B細胞刺激因子，促使B細胞分泌免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)，從而參與B細胞的生長、分化與抗體產生[10-11]。推測MNV感染導致乙肝疫苗效價測定值偏低主要有以下兩點原因：一是病理方面因素：乙肝疫苗效價測定使用的是BALB/c小鼠，病理研究發現BALB/c小鼠脾發生的病理變化主要表現為脾小結數量的減少[12]，脾小結位于脾白髓中央動脈周圍淋巴鞘的旁側，為B細胞區，脾小結數量減少意味著淋巴細胞數量的減少，動物免疫力的降低；另一個原因是MNV感染造成的小鼠免疫功能的改變，輔助性T細胞分為Th1和Th2細胞，兩種細胞之間通過分泌細胞因子，彼此交叉調節又互相抑制。我們先前報道的免疫指標變化研究中，MNV感染導致BALB/c小鼠γ干擾素(IFN-γ)含量顯著升高[6]，而IFN-γ作為Th1的效應分子，具有輔助細胞免疫的作用，同時其高表達對Th2細胞的增殖分化又產生了抑制，而Th2細胞起輔助體液免疫的作用，因此間接影響到了小鼠的體液免疫應答。根據以上兩點原因推測MNV感染影響了小鼠的體液免疫應答，進而影響到乙肝疫苗效價測定的結果。

本研究在MNV感染第7天進行免疫，屬于感染的急性期，慢性期免疫(感染30 d后)是否同樣會對乙肝疫苗效價的測定產生影響？先進行乙肝疫苗的免疫再感染MNV，以及免疫后的不同時間感染會產生什么影響？要進一步深入了解MNV感染對乙肝疫苗的影響，這些問題都有待后續進行深入研究。

致謝：感謝中檢院肝炎室邱少輝等同事提供的幫助！