2型糖尿病視網膜病變大鼠模型建立*

朱曉燕 劉 勤, 白惠玲 金 濤 張 書 張延英 康萬榮

(1. 甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院/甘肅省人民醫院，蘭州 730000)(2. 甘肅中醫藥大學科研實驗中心，蘭州 730000)(3.甘肅省人民醫院眼科，蘭州 730000)

2型糖尿病(rype 2 diabetes mellitus，T2DM)是臨床最常見的慢性病及基礎疾病之一。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，T2DM的發病率也呈逐年升高趨勢[1]。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是T2DM患者中較常見的一種微血管并發癥，亦是導致盲眼病的重要原因[2]。根據Olivares等[3]報道，國內對DR的研究多集中在1型DR模型上，理想的2型DR動物模型仍處發展階段，國外建立2型DR動物模型多采用基因敲除法。由于條件所限，國內用這種方法建立模型尚有困難，且因無法在活體上動態的監測視網膜變化，國內以往對于DR大鼠視網膜的觀察多在離體眼球上進行，導致動物所需數量較多。因此，研究較為簡單的方法建立理想的2型DR模型并優化觀察視網膜的方法具有一定的現實意義。本研究采用SD大鼠建立2型DR模型，并通過眼底熒光造影(fundus fluorescein angiography，FFA)和病理形態改變動態的觀察視網膜，以了解大鼠眼底血管形態及病變嚴重程度，以期為DR相關治療提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SD大鼠80只，雄性，6周齡，體質量(150±20)g，購自甘肅中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SYXK(甘)2020-0009，所有大鼠屈光間質清晰，外眼及眼前節檢查均無異常表現，常規飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗室。實驗動物處理遵守甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院實驗動物倫理原則，實驗動物倫理審查編號：2020-298。

1.1.2試劑與儀器：鏈脲佐菌素(strep-tozotocin，STZ)，購自北京索萊寶科技有限公司，批號616S0212；檸檬酸和檸檬酸鈉，購自天津市大茂化學試劑廠，批號20161101，20171010；復方托吡卡胺滴眼液購自沈陽興齊眼藥股份公司，批號200802；熒光素鈉注射液，購自Alcon Research LLC，批號314040F；血糖儀及試紙，購自拜耳(中國)有限公司，批號DP9LM3F02 A；大鼠胰島素ELISA試劑盒，購自江蘇菲亞生物科技有限公司；高脂高糖飼料，購自沈陽茂華生物科技有限公司，生產許可證號SCXK(遼)2017-0001，基礎飼料上加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇及1%膽酸鈉；眼球固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；眼底血管熒光造影機(型號SpectralisHRA+Multicolor)購自德國海德堡公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠分組及造模：將所有大鼠按隨機數字表法分為空白對照組及T2DM組，n=40。造模方法根據王保偉等[4]研究，將所有大鼠適應性喂養1周后，空白對照組給予普通飼料，T2DM組給予高脂高糖飼料，喂養4周，禁食不禁水16 h后，T2DM組按30 mg/kg腹腔注射STZ(STZ溶于0.1 mol/L的pH 4.5的檸檬酸鈉緩沖液中，配成1%溶液，現配現用，30 min內用完)以誘發T2DM；空白對照組僅注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，在大鼠尾靜脈采血，用血糖儀檢測血糖濃度，凡空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L、HOMA-IR增加伴尿量及飲水量均明顯增多的大鼠作為T2DM成模標準。模型成立后，將T2DM組40只大鼠隨機分為造模后3個月組、造模后4個月組、造模后5個月組及造模后6個月組，每組10只。

1.2.2模型的觀察指標:注射STZ后，每天觀察并記錄大鼠的一般狀況，主要包括精神狀態、毛發顏色、運動情況、攝食量、飲水量、墊料潮濕程度等，并及時更換尿濕的墊料；每周測量各組大鼠的體質量、隨機血糖、空腹血糖及空腹血清胰島素(FINS)指標，比較各組的體質量變化及血糖值變化并計算分析HOMA-IR(=空腹血糖×FINS/22.5)。

1.2.3FFA檢查:大鼠T2DM造模后3個月、4個月、5個月及6個月進行FFA檢查。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg進行麻醉，雙眼滴復方托吡卡胺散瞳，將大鼠麻醉、散瞳后移至熒光造影機前，按0.5 mL/kg向腹腔注射10%熒光素鈉，注射后即開始攝影，主要以視盤為正中心拍攝中心圖。另外，根據實際情況可拍攝上、下、左、右的視網膜情況。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色:分別于T2DM造模后3個月、4個月、5個月及6個月FFA檢查完畢后頸椎脫臼處死大鼠，迅速摘除眼球，眼球固定液固定，石蠟包埋后切片，切片時定位到靠近視神經完整的視網膜進行縱切，使切片之間具可比性，HE染色，光學顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 一般情況觀察

空白對照組大鼠精神狀態良好，毛發柔順光滑，活潑好動，每日攝食量和飲水量適中，墊料干燥；T2DM組大鼠STZ腹腔注射后第1周，大鼠表現出多食、多飲、多尿及體質量減輕的糖尿病癥狀，隨著病程延長，大鼠逐漸表現出精神萎靡，毛發雜亂枯黃、易脫毛，倦怠懶動，每日的飲食、飲水及尿量明顯增多，墊料潮濕并伴爛蘋果味。隨時間增加，上述癥狀愈加明顯，伴體型極度消瘦萎靡、皮包骨樣、弓背蜷縮且狀態不佳。

2.2 體質量及血糖變化

造模前，空白對照組與T2DM組大鼠體質量和血糖差異無顯著性(P>0.05)；造模后，空白對照組大鼠體質量穩定增加，T2DM組大鼠體質量增加不明顯且隨著時間的延長伴有不同程度的減輕。T2DM造模后3個月、4個月、5個月及6個月時大鼠體質量明顯減輕，與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)；血糖顯著升高，與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)，見圖1和圖2所示。

圖1 不同病程各組大鼠體質量變化趨勢

圖2 不同病程各組大鼠血糖變化趨勢

2.3 HOMA-IR比較

造模前，空白對照組和T2DM組大鼠FINS和HOMA-IR差異無顯著性(P>0.05)；造模后，T2DM組FINS和HOMA-IR較空白對照組顯著升高，經統計學處理后差異極顯著(P<0.01)。造模后，FINS和HOMA-IR之所以升高，考慮原因是高脂高糖飼料喂養聯合小劑量STZ注射只是部分破壞了大鼠胰島B細胞功能，說明此種造模方法已經成功復制出了大鼠胰島素抵抗模型，即T2DM模型(表1)。

表1 造模前后兩組大鼠FINS和HOMA-IR比較

2.4 FFA檢查情況

空白對照組大鼠眼底清晰且視網膜血管走行規則、粗細均勻一致并以視盤為中心呈放射狀分布；T2DM組：3個月大鼠眼底尚清晰、視網膜血管走行迂曲、可見微動脈瘤及少量點狀強熒光；4個月大鼠視網膜血管不規則擴張、并可見毛細血管叢及大面積強熒光滲漏；5個月大鼠眼底模糊、血管周圍可見熒光滲漏及片狀出血；6個月大鼠因晶體混濁眼底窺不清、隱見血管走行迂曲且血管周圍可見熒光滲漏及出血(圖3)。

圖3 不同病程各組大鼠FFA結果

2.5 HE染色

空白對照組大鼠視網膜各層結構完整且排列整齊、細胞形態正常、內界膜清晰可見，神經節細胞單層排列，內核層由3～5層細胞構成，外核層較厚，由8～10層細胞排列而成；T2DM組3個月大鼠，各層細胞排列紊亂，神經節細胞層可見擴張的血管(×200)，內外核層細胞數量減少，排列稀疏；T2DM組4個月大鼠，各層細胞排列紊亂且界限不清，神經節細胞層可見血管樣結構，視網膜神經節細胞層及內、外核層水腫；T2DM組5個月大鼠，神經節細胞水腫，可見突破內外叢狀層的血管樣結構，神經節細胞數量減少，內外核層界限不清、細胞稀疏、排列紊亂、出現空泡樣變和異常血管樣結構；T2DM組6個月大鼠，神經節細胞進一步減少，內外核層間界限消失，結構紊亂甚至中斷，細胞排列雜亂無章，神經節細胞層和內外核層空泡樣變性明顯，可見大量穿行于內外核層的迂曲血管，見圖4所示。

圖4 不同病程各組大鼠視網膜HE

3 討論

DR作為T2DM嚴重的微血管并發癥，可導致視力永久性喪失[5]，而該病的患病率也在逐年增加，據估計到2040年全球約有6.24億人患有糖尿病[6]，其中T2DM占糖尿病總數的90%～95%[7]。臨床研究表明，DR的發病與T2DM的病程和血糖水平直接相關[8]，因此建立理想的T2DM動物模型是研究DR的重要基礎。

根據林春華等[9]，T2DM動物模型按造模方式主要分為三類：自發性T2DM動物模型、誘導性T2DM動物模型和轉基因T2DM動物模型，但是自發性和轉基因T2DM動物因價格昂貴、來源相對較少等缺點，限制其在科學研究方面的應用和普及，而實驗性T2DM動物模型則因為成本較低、操作簡便、重復性高等優點，應用最為廣泛。建立T2DM動物模型常用的實驗方法包括手術誘導、飲食誘導、藥物誘導、聯合誘導等，其中因聯合誘導(高脂高糖飲食聯合小劑量STZ)的T2DM大鼠能較好的模擬T2DM的發病因素、病理過程和臨床特征，并且造模時間相對較短，成本相對較低，而成為該病的理想造模方法[10-11]。高脂高糖飲食可通過降低實驗動物的胰島素敏感性，使機體糖耐量降低從而誘發胰島素抵抗[12]。STZ是一種廣譜抗菌素，對動物胰島B細胞具有特異性的毒性作用，它會選擇性損傷胰島B細胞，導致胰島素分泌減少[13]，而胰島素抵抗和胰島功能受損是T2DM的典型病理生理特征和重要依據[14]。Gheibi等[15]以高脂喂養大鼠2周后，單次腹腔注射STZ 30 mg/kg 建立T2DM模型；Gomaa等[16]以高脂喂養大鼠4周后單次腹腔注射STZ 25 mg/kg建立T2DM模型。因此，結合上述文獻報道和預實驗結果，本研究改進實驗方法，采用高糖高脂飲食喂養4周聯合小劑量STZ 30 mg/kg腹腔注射建立T2DM大鼠模型，大鼠模型血糖維持較好，且在長達6個月的實驗周期內無一死亡。

雖然有大量的物種被用于制作DR模型，比如小鼠、大鼠、貓、狗、豬和非人靈長類動物，但大鼠模型仍是最常被研究的，因為它們體積適中、壽命短且繁殖速度快，可以進行最有效的研究[17]。目前，國內DR模型常用的大鼠品系是SD大鼠或者Wistar大鼠。章成昌等[18]選用Wistar大鼠，因為Wistar大鼠不僅有SD大鼠的優良基因，且比SD大鼠更溫順，有利于實驗操作的進行和實驗數據的采集，但是農慧等[19]用相同劑量的STZ造模，發現Wistar大鼠的死亡率可以達到50%以上，可見SD大鼠的抵抗力強于Wistar大鼠。由于本實驗周期長，對大鼠的生存能力要求較高，故選用SD大鼠。

莊秋霞等[20]和姜曉丹等[21]研究表明，FFA是臨床上診斷DR時最常采用的一種方法，它可以通過動態反映視網膜毛細血管的實時循環情況從而實現DR的早期診斷和分期，即使是微小病變也能準確捕捉，而目前DR大鼠模型驗證方面恰恰缺乏這部分內容。以往國內針對DR大鼠視網膜的觀察主要在離體眼球上進行[22-24]，但這些方法較為局限，因為無法在活體上動態觀察眼底改變，它意味著必須先處死大鼠才能觀察到視網膜，因此大鼠使用量較大，不符合3R操作原則。鑒于此，本研究結合FFA和HE染色，在活體動態監測T2DM大鼠視網膜出現病變的基礎上，再處死大鼠進行視網膜組織病理學改變的觀察，研究方法的改進在符合動物倫理學要求的原則下更加全面的模擬T2DM的DR大鼠模型。由于條件所限，本研究對大鼠行FFA檢查時，使用為人眼設計的海德堡血管造影機，但人眼球的參數與大鼠眼球參數存在明顯區別，這種差異導致需要耗費大量時間調整動物眼位才能獲得FFA圖像。若能改進技術，可以調整適應大鼠的眼球參數，便能更加簡便地獲得DR大鼠FFA圖片。同時在研究過程中，隨著T2DM大鼠病程的延長，尤其至6個月時，大鼠普遍發生白內障，嚴重的晶狀體混濁導致FFA不能評估視網膜血管的變化并無法獲得清晰的FFA圖片。如果研究初期，能同時結合光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)、FFA和HE技術，不僅能對補后期難以進行的FFA問題，還有助于活體上觀察T2DM大鼠視網膜厚度的動態變化，從而可以進一步與HE結果對比分析，這無疑對研究DR模型具有更重要的意義。

總之，本研究通過高脂高糖飼料喂養4周聯合30 mg/kg STZ腹腔注射建立的T2DM大鼠模型，并應用FFA和病理學技術動態監測到T2DM大鼠在病程3個月時觀察到視網膜血管發生的病變，同時也觀察到DR的病理形態學改變。隨著病程延長，病變也在逐漸加重。因此，該模型的成功建立以及病變的驗證方法可以被進一步用于研究T2DM的DR發病機制及對新型抗DR藥物的評估。