納米羥基磷灰石的制備及在不穩定藥物遞送中的應用

劉丹，王強，范興君，高俊霞，于鳳波,3

(1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011；3.廣東醫科大學附屬高州市人民醫院，廣東 茂名 525299)

1 納米羥基磷灰石

納米藥物載體(粒徑10～1 000 nm)，是一種微觀范疇的藥物載體輸送系統，它的基質材料通常是天然或合成的高分子物質，通過吸附或者包被作用從而將靶藥物聚集在亞微粒的內部或表面，用于實現調節藥物進入體內后的釋放速度、增加膜通透性、提高生物利用度等[1-2]。納米藥物載體一般具有多孔、中空等結構特性，而這些特性使其能夠對藥物在體內緩慢釋放。通過優化載體材料的種類和配比，控制藥物的釋放速度，最大程度減少用藥的次數、劑量，以減輕該藥物的毒副作用[3-4]。納米藥物載體材料主要分為兩大類——無機類和有機類，其中無機類主要包括納米羥基磷灰石和介孔硅基材料，有機類包括天然及合成高分子材料。

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)，作為人體內骨骼和牙齒的主要構成成分，不僅無害副作用，而且具有良好的生物相容性。目前，基于HAP的物理、化學及生物學特性，其往往于骨科充當藥物植入載體的角色。此外近年來，有研究嘗試將HAP運用于三維打印(three dimensional printing，3DP)技術領域，將其與聚乳酸基質一同作為3DP打印緩釋制劑的材料，凸顯出了較好的市場應用前景[5-6]。結構決定功能，功能決定用途，具有多種結構的HAP自然也具有各領域的不同用途，其中人工所合成的高密度HAP主要被用于醫學骨修復以及骨植入領域的支架材料[7]，而具有高效吸附特性的多孔性HAP往往被應用于核酸及蛋白質等生物大分子的分離及純化實驗。然而，隨著HAP尺寸下降達到納米級別時，其會呈現出一系列的新的獨特優異性能，不僅具有很大的比表面積，表現出較常規HAP材料更強的藥物吸附與承載能力，并且由于粒徑極小(10～1 000 nm)，其能無障礙的通過癌細胞的細胞膜通道，從而進入到癌細胞的內部發揮其生物效應，進而抑制癌細胞的無限增殖[8]。納米HAP制備方法眾多，并且合成所需的各種原材料也廉價易得，采用不同方法制備所獲得的HAP具有不同的化學結構與功能。

2 納米羥基磷灰石的制備

隨著科學技術的快速發展，羥基磷灰石的制備工藝得到了顯著的改進，目前制備HAP的方法主要包括干法和濕法[9-10]兩種合成方案。其中，干法合成方法通常能夠獲取到化學計量和結晶相對良好的產品，但具有需要相對較高的反應溫度以及較長的反應時間等缺陷。此外，該方法還必須通過研磨才能進一步獲得納米粒子。然而，相較于干法合成方法而言，濕法合成方法所需求的反應溫度相對較低也更為容易產生納米顆粒，其不足是該法所制備的產品具有相對較低的結晶度和Ca/P比率。不同的制備工藝制備的HAP在形態結構上存在一定差異。

2.1 干法合成 干法合成法(包括固態合成法和機械球磨法)，又稱固相反應法，是以既定的比例將3種固體原料[Ca(OH)2、Ca3(PO4)2、NaOH]相混合，并分散均勻，通過控制水蒸氣的溫度在1 000 ℃以上，促使一系列反應于相界面上得以發生，從而使固體混合物HAP析出并獲得其粉體。

2.1.1 固態合成法 固態合成法[11]是一種利用高溫煅燒的方式以各種研磨后的磷酸鹽為原料來獲得HAP，常用于HAP粉末的合成，這種合成方法的制備工藝相對來說比較簡單，但這種在固態條件下合成的HAP粉末具有擴散系數較小的特點，以及粒子的組成具有不均勻性。該制備方法于2001年被Tas等[12]首次報道。具體流程為利用粗制的HAP(微米級)為原料，在硫酸鉀(K2SO4)的助熔條件下，多次嘗試改變反應過程中的各類條件(包括溫度、時間、反應物比例等)，最終于1 080～1 200 ℃得到了呈現出納米晶須結構的HAP。

2.1.2 機械球磨法 機械球磨法[13]主要用于合成各種納米陶瓷和塑料合金，通過機械磨球與塑料磨球之間，磨球與熱塑料罐兩者之間的強力碰撞，使納米粉末材料發生快速變形、破碎。這些被破碎的粉末在隨后的球磨的過程中又再次發生冷卻熔焊和融合，再次被球磨破碎，致使晶粒不斷細化，可以迅速達到一個納米數量級。其主要特點在于操作簡單、成本低、重現好，但產品顆粒純度低，顆粒結構分布不均勻。有研究報道[14]，將Ca(NO3)2·4H2O、Na3PO4按Ca/P為1.67比例混合后，于瑪瑙缽中分別研磨5 min、20 min，微波加熱，乙醇和蒸餾水洗滌產物后，烘干得到HAP粉體。結果表明，該方法成功縮短反應時間，降低反應溫度，并制備出不同形貌的納米HAP。

2.2 濕法合成

2.2.1 水熱合成法 水熱合成法[15]是指在密閉的高溫、高壓容器中，用少量水或其他水溶液作為熱反應催化劑的加熱介質，通過溫度及壓力的控制使本來難溶或不溶的固體發生溶解并出現重結晶的一種方法(壓力鍋加熱方式：反應溫度范圍約100～400 ℃，反應的壓力約1～200 MPa)。由該方法制得的HAP粉體，它的晶粒發育完整，粒度小且分布均勻，容易獲得粉體的化學反應計量物和晶型，但對于反應條件、設備質量要求嚴格，反應現象復雜，肉眼不容易觀察。Lai等[16]采用碳酸鈣(CaCO3)為模板，水熱條件下通過陰離子交換樹脂，在Na2HPO4溶液中成功制備了一種中空的HAP納米球，其粒徑范圍在800～2 000 nm之間。此外，Qi等[17]也利用水熱法得到了一種片狀的HAP，具體方法為：以乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)為螯合劑，尿素為pH調節劑，通過調節水熱處理溫度和時間，可以很好地控制碳酸化HAP產物的形貌和三維結構。

2.2.2 溶膠-凝膠法 溶膠-凝膠法[18]是指將堿性金屬與乙醇鹽或其他無機鹽等化學原料均勻分散在各種有機溶劑中，而后通過一系列化學反應(高溫水解/醋酸醇解)后生成比較穩定而透明的納米溶膠，該溶膠再經過高溫陳化后，逐步聚合，進而反應生成一種具有一定空間結構的納米凝膠，而后經過干燥、煅燒等手段去除有機成分后制備出各種納米化學粒子或所需材料。該方案的具體流程為：于磷酸鹽溶膠中緩慢滴入鈣鹽，隨后再加入不同量的碳酸氫氨，利用氨水本身的特性調節反應溶液的酸堿度，其后制得的凝膠經陳化、洗滌、干燥、焙燒等工藝最終獲得目標產物。該法操作簡便、反應溫和，但合成過程耗時較長。

Bakan等[19]利用四水硝酸鈣和磷酸氫二銨為原料，采用溶膠-凝膠法成功制備HAP，為呈六方形的納米針顆粒。黃龍宵等[20]以四水硝酸鈣和五氧化二磷為原料，制備了顆粒狀HAP粉體，將其熱處理后得到一種六方形結構的納米晶體。徐曉虹等[21]利用溶膠-凝膠法制備的HAP，它的結構含碳酸根并且粒徑很小，在40～50 nm之間，同時還發現在制備過程中用乙醇作為反應溶劑時，制得的HAP納米顆粒不僅分散性好，而且仿生性能也提高了。

2.2.3 化學沉淀法 化學沉淀法[22]合成HAP是通過把磷酸鹽加入鈣鹽中，控制Ca/P比例為1.67，充分攪拌完成反應后，加入少量堿性溶液(氨水或氫氧化鈉等)調節溶液的酸堿度，產生多個羥基磷灰石鹽的沉淀，然后再通過陳化、洗滌、過濾、烘干等多個步驟后，采用400 ℃以上的高溫煅燒獲取干燥HAP，從而制得純凈的HAP晶體。但值得指出的是：該制備方法不僅在制備工藝條件的要求極為嚴格，同時，由于所制備條件的限制，其所獲得的新型納米HAP顆粒粒徑的均勻性較差，也可能伴隨出現嚴重的團聚擴散現象。孫海娜等[23]用化學沉淀法，以PEG-8000為模板，制備了平均粒徑100 nm的Eu3+摻雜的片狀納米HAP。尹美林等[24]用化學沉淀法制備了平均粒徑為145 nm的HAP納米晶，具有較好的穩定性。

2.2.4 酸堿反應法 酸堿反應法[13]主要是根據酸、堿中和反應的原理生成HAP。該方法操作簡便，所需設備簡單，更適合用于工業化生產，但鑒于其液-固多相反應的屬性，易分解成溶膠產物，具有分離相對困難，以及反應時間較長等不足。

2.2.5 水解法 水解法[25]是一種綜合反應法，先制備固體前驅體CaHPO4，隨后設定相應的水解條件(溫度70 ℃)以及酸堿度(pH=8.5)以達到在晶格中加入氫氧根離子的目的，從而得到不同形貌的納米顆粒。此方法的基本原理是利用水解反應(固體氣相液體表面與未溶解的離子)，具有可控性好的優點。Wang等[26]以CaHPO4為原料，在75℃水解制備了粒徑范圍為13.7～23.1 nm的HAP納米粉體。

2.2.6 微乳液法 微乳液法[27]是指以含鈣和磷酸鹽為原料的反應體系中添加表面活性劑(增加反應體系的分散性)，利用水和有機助溶劑的相互作用而形成乳液，進而沉淀析出羥基磷灰石。該方法具有工藝簡單，粒徑可控(一般分布在10～100 nm)等優勢，但該方法收率較低，需要使用大量的有機溶劑，一方面具有較大風險會對人體和環境造成危害，另一方面是其制作成本較其他方法更高。Bose等[28]以表面活性劑為模板，環己烷為油相，硝酸鈣和磷酸為水相合成了HAP粉末，其粒徑為30～50 nm，結構形貌呈針狀和球形。

2.2.7 模板法 模板法[29]是基于某種具有特征結構的物質為模板，于特定實驗條件下，計算得到包含模板結構的目標物的方法。例如，利用表面活性劑吸附鈣離子和磷酸根離子并進而形成膠束。用該方法所制得HAP結晶粉末不僅其形貌可控，而且具有諸多優點，顆粒分散性高而團聚現象比較輕微。張愛娟等[30]以中空的CaCO3為模板獲得了中空HAP微球。但受限于Ca2CO3模板的大小，大規模的運用該方法生產HAP微球是極其困難的。

3 納米羥基磷灰石在不穩定藥物遞送中的應用

目前，以RNA為代表的基因藥物具有新藥開發周期短、序列特異性高、體內具有內源性、毒副作用小等諸多優點。在歷經二十幾年的研發后，美國三大RNA研發公司BioNTech、Moderna Therapeutics和CureVac AG在多家全球醫藥巨頭的支持下，近年來研發的腫瘤、傳染病、心血管等多種疾病的RNA疫苗，紛紛進入臨床試驗及實際應用當中。由于此類藥物在體內極易被核酶發現降解且細胞透過率低，很難到達細胞內發揮藥效，因此，將其遞送至細胞內的載體技術至關重要。近年來，納米HAP及其復合材料作為抗生素類藥物[31-32]、蛋白質與核酸等基因藥物[33-38]緩控釋載體材料已有諸多報道。

3.1 納米羥基磷灰石在抗生素中的應用 Lai等[16]以多孔中空羥基磷灰石微球為載體，鹽酸阿霉素(DOX)作為模型藥物，探索了其在載藥量和藥物控釋方面的潛在應用。結果顯示，制備的聚羥基磷灰石微球在負載DOX時表現出高的載藥量和對酸堿度敏感的緩、控釋行為。Ait Said等[32]采用固-液混合法，以羥基磷灰石(HAP)、殼聚糖(CS)、環丙沙星(CIP)為原料，通過優化固-液比和少量殼聚糖的使用，制備了羥基磷灰石和殼聚糖聚合物負載環丙沙星抗生素的復合材料。其體外釋放試驗表明，該局部負載抗生素的代骨材料在菲式擴散機制下，能保證載荷劑量(0.2～2.5 mg·d-1)持續10 d。

3.2 納米羥基磷灰石在蛋白質分離和純化中的應用 Esfahani等[33]通過化學沉淀法以3種不同的成分制備了帶正電的含鋅羥基磷灰石(x-ZH)納米顆粒，在靜電紡絲尼龍-6納米纖維(NFs)上創建了一個帶正電的表面，即牛血清白蛋白(BSA)，以改善帶負電蛋白質吸附的分離和選擇性。研究結果表明，x-ZH納米粒子在尼龍纖維中分布良好，具有足夠的拉伸強度(4.15～5.70 MPa)，在對BSA進行吸附時，摻鋅羥基磷灰石的靜電紡絲尼龍膜(N-4ZH：4表示鈣位點被鋅陽離子所占據，即N-xZH膜中鋅含量)對蛋白的吸附時間較長。N-4ZH膜能在1 h內分離250 mg·cm-3BSA分子，表明該膜具有捕獲蛋白質的潛力。此外，已有研究團隊[34]利用合成的納米HAP作為載體(以牛血清白蛋白(BSA)作為將負載的藥物)，測定不同條件下HAP的吸附量及其負載藥物的釋放度。相應的研究數據表明，HAP納米顆粒能夠勝任該類緩釋藥物的載體角色。

3.3 納米羥基磷灰石在核酸中的應用 研究表明[35]磷酸鈣(CaP)基因載體(如HAP)可以克服內體逃逸、酶降解和核吸收的障礙，它不需要使用額外的化合物來破壞核內體。HAP是牙齒和骨骼的主要成分，因此具有高度的生物相容性，不會引發免疫原性或炎癥反應。有報道稱，Ca2+與帶負電荷的基因分子(如DNA和RNA)之間的靜電相互作用提高了攜帶基因的穩定性，這可以保護基因不受細胞質和核降解的影響。Ca2+濃度的增加通過滲透失衡和基因載體分離促進內體破裂，這是發生核酸進入之前所必需的。高可雷等[36]早期研究結果也顯示攜有NT-3基因的納米HAP顆粒，不僅可轉染到體外培養的小鼠耳蝸神經元中，亦能轉染到活體豚鼠的耳蝸神經元內。

Liang等[37]利用羥基磷灰石納米顆粒(HAP)提供的基于質粒的Stat3特異性短發夾RNA(sh-Stat3)，研究了信號轉導子和轉錄激活子3(Stat3)干擾對體外培養的RM1前列腺癌細胞活力的影響。結果表明，通過促進細胞周期阻滯和凋亡，HAP遞送的sh-Stat3顯著降低RM1細胞的活力。Balagangadharan等[38]制備出載miR-590-5p的殼聚糖/納米羥基磷灰石/納米二氧化鋯骨再生支架，利用小鼠間充質干細胞(C3H10T1/2)，在細胞和分子水平上檢測生物活性分子(miR-590-5p)對支架的成骨細胞分化的影響。結果顯示CS/nHAP/nZrO2支架促進成骨細胞分化，在C3H10T1/2細胞中miR-590-5p的存在進一步增強了這種作用。

4 展望

作為可在人體內應用的藥物遞送載體，需要具備良好的生物相容性和可降解性，良好的理化和生物穩定性，極低的毒性，以及更高的藥物負載能力。HAP的組成與人類骨骼和牙齒大致相同，與其他微生物具有良好的相容性，并且能夠于機體內代謝降解后通過消化道隨著糞便一同排出體外，因此，其對于機體來說也具備較高的安全性；不同形狀的納米HAP具有極高的比表面積以及載藥空隙，因此在納米級制劑載體中，藥物負載能力較強，這也是納米HAP被選作藥物遞送系統的必要條件。由目前的文獻報道來看，納米HAP及其復合物是一種具備高載藥能力，高保護能力和高轉染性能的無機納米材料。因此，其在未來基因藥物及抗腫瘤藥物的體內遞送方面極具發展潛能。