乙肝相關性慢加急性肝衰竭合并細菌感染患者Treg/Th7細胞免疫表達的研究

譚年花　陳斌　彭杰　朱文芳　張茜茜

〔摘要〕 目的 觀察乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）相關性慢加急性肝衰竭（hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure， HBV-ACLF）合并細菌感染患者外周血調節性T細胞（regulatory T cell， Treg）和輔助性T細胞17（helper T cell 17， Th17）細胞計數及相關細胞因子免疫表達。方法 選擇96例HBV-ACLF患者，依據感染情況分為有細菌感染組與無細菌感染組。采用流式細胞術檢測患者外周血Treg、Th17細胞計數，細胞因子微球檢測技術檢測轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、白介素-10（interleukin-10， IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-17A（interleukin-17A， IL-17A）、白介素-23（interleukin-23， IL-23）表達，實時熒光定量PCR檢測叉狀頭狀轉錄蛋白3（forkhead box protein 3， Foxp3）、維甲酸相關孤核受體-γt（retinoid-related orphan nuclcar receptor-γt， ROR-γt） mRNA表達，及檢測相關炎癥指標[C反應蛋白（C-reactive protein， CRP）、降鈣素原（procalcitonin， PCT）、內毒素（lipopolysaccharide， LPS）]水平。結果 有細菌感染組Treg細胞計數與無細菌感染組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與無細菌感染組比較，有細菌感染組Th17細胞計數明顯升高（P<0.01）;有細菌感染組CRP、PCT、LPS水平均顯著升高（P<0.01，P<0.05）;有細菌感染組Th17、TNF-α、IL-17A、IL-23、ROR-γt mRNA表達均明顯上調（P<0.01，P<0.05）;有細菌感染組Foxp3 mRNA、IL-10表達均明顯下調（P<0.01，P<0.05）。有細菌感染組惡化率（83.33%）顯著高于無細菌感染組（11.11%）（P<0.01）。結論 HBV-ACLF患者隨著病程進展，感染風險增加，其感染后存在Th17細胞優勢化現象，具體機制可能與Th17細胞過度增值分化導致炎癥反應失控，加重肝組織炎癥反應相關。

〔關鍵詞〕 乙型病毒性肝炎;肝衰竭;調節性T細胞;輔助性T細胞17;細菌感染

〔中圖分類號〕R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕B? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.023

〔Abstract〕 Objective To observe the cell count of regulatory T cell （Treg） and helper T cell 17 （Th17） cell and the expression of related cytokines in peripheral blood of patients with hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF） combined with bacterial infection. Methods 96 patients with HBV-ACLF were divided into bacterial infection group and non-bacterial infection group according to the infection. Flow cytometry was used to detect the cell count of Treg and Th17 in peripheral blood. The expression levels of transforming growth factor-β （TGF-β）， interleukin-10 （IL-10）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-17A （IL-17A） and interleukin-23 （IL-23） were detected by cytometric bead array. The expression of forkhead box protein 3 （Foxp3） and retinoid-related orphan nuclcar receptor-γt （ROR-γt） mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and the levels of C-reactive protein （CRP）， procalcitonin （PCT） and lipopolysaccharide （LPS） were detected. Results There was no significant difference in Treg cell count between the bacterial infection group and non-bacterial infection group （P>0.05）. Compared with the non-bacterial infection group， Th17 cell count in bacterial infection group was significantly increased （P<0.01）， CRP， PCT and LPS were significantly increased in the bacterial infection group （P<0.01， P<0.05）. The expression of Th17， TNF-α， IL-17A， IL-23 and ROR-γt mRNA in the bacterial infection group were all up-regulated （P<0.01， P<0.05）， Foxp3 mRNA and IL-10 expression were significantly down-regulated in bacterial infection group （P<0.01， P<0.05）. The deterioration rate in the bacterial infection group （83.33%） was significantly higher than that in the non-bacterial infection group （11.11%） （P<0.01）. Conclusion Patients with HBV-ACLF have an increased risk of infection with the progression of the disease， and there is a phenomenon of Th17 cell dominance after infection. It may be related to the excessive value-added differentiation of Th17 cell， which leads to the uncontrolled inflammatory response and aggravates the inflammatory response of liver tissue.

〔Keywords〕 viral hepatitis B; liver failure; regulatory T cell; helper T cell 17; bacterial infection

慢加亞急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure， ACLF）是在慢性肝病基礎上出現以肝功能急性失代償為特征的臨床綜合征，預后差，病死率高[1]。其發病機制與宿主免疫損傷、缺血缺氧及再灌注損傷密切相關，我國則有80%以上是乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）相關性慢加急性肝衰竭（hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure， HBV-ACLF）[2-3]。HBV-ACLF患者由于免疫功能紊亂（過度炎癥反應與免疫功能障礙重疊）、腸道細菌失調、腸道菌群/產物易位等病理生理特征，極易感染[4-5]。合并感染作為肝衰竭最常見的不良事件之一，是導致肝衰竭重癥化的重要原因，大大增加了重癥監護病房入院率和短期死亡率[6]。西醫治療上目前除了抗感染、退熱、免疫調節等對癥治療，尚無其他療效確切的藥物，并且因受損臟器的特殊性，大大限制了臨床用藥。而臨床與實驗研究表明通過傳統中醫辨證論治，也能達到較好的療效，認為細菌感染的病理因素無外乎熱、毒與血瘀，病機表現為（熱）毒、瘀、虛，與肝衰竭濕熱、血瘀、脾虛的基本病機相合，可予以清熱涼血、解毒化瘀，兼以補虛治療，再配合通腑泄濁、祛邪外出以截斷挽逆，控制病勢進展[7-8]。因此，利用現代分子生物學再結合傳統中醫辨證，多維度認識肝衰竭發病機理，形成其中西醫結合診療的新理念，已是臨床治療趨勢。

肝衰竭患者出現感染可能主要與兩種損傷機制相關：（1）機體過度的免疫應答損傷正常組織，增加易感率;（2）感染性生物直接損傷組織[9]。然而在HBV-ACLF背景下，血液免疫細胞亞群的計數、免疫細胞表面蛋白的表達和轉錄譜特征還未得到系統研究。起源于CD4+T細胞的調節性T細胞（regulatory T cell， Treg）和輔助性T細胞17（helper T cell 17， Th17）是ACLF發病后適應性免疫反應中最具代表的T細胞亞群之一[10]。Treg細胞受叉頭狀轉錄蛋白3（forkhead

box protein 3， Foxp3）調控，通過分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、白介素-10（interleukin-10， IL-10）等抑炎細胞因子，發揮抑制炎癥作用，Th17細胞在維甲酸相關孤核受體-γt（retinoid-related orphan nuclcar receptor-γt， ROR-γt）的調控下，通過分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-17A（interleukin-17A， IL-17A）、白介素-23（interleukin-23， IL-23）等促炎細胞因子，加重炎癥反應[11]。二者在ACLF發病過程中的炎癥調控作用是近年國內外研究的熱點[12-14]，其具體表達與肝衰竭患者的感染風險增加是否有關，目前研究較少。因此，本研究以HBV-ACLF患者為研究對象，通過觀察HBV-ACLF合并感染患者外周血炎癥指標、Treg、Th17細胞計數及相關細胞因子免疫表達，有助于為ACLF炎癥反應調控的研究提供全新視角和新思路。

1 資料與方法

1.1? 一般資料

選取2018年3月至2019年3月收住于湖南中醫藥大學第一附屬醫院肝病科/傳染性疾病科的HBV-ACLF患者共96例，依據患者是否合并細菌感染，分為有細菌感染組42例和無細菌感染組54例。依據ACLF病程分期，有細菌感染組分別有7例早期患者、13例中期患者、22例晚期患者，主要分布在疾病晚期。在性別年齡分布上，42例有細菌感染組中男性31例，女性11例，年齡（48.34±18.51）歲，54例無細菌感染組中男性41例，女性13例，年齡（45.62±16.33）歲。各組在性別、年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（批準號：HN-LL-20170720）。所有患者皆被告知參與研究的相關內容，充分知情后自愿簽署知情同意書。

1.2? 診斷標準

HBV-ACLF診斷參照《肝衰竭診治指南（2012年版）》的診斷標準[15]。細菌感染診斷標準[16]：血、尿、糞便、腹水、胸水等病原學檢測明確提示細菌培養陽性者;或病原微生物學培養陰性，但臨床上有可疑感染灶的相應癥狀和體征，外周血相關炎癥指標白細胞和（或）中性粒細胞、C反應蛋白（C-reactive protein， CRP）、降鈣素原（procalcitonin， PCT）升高，以及X線、CT等影像學檢查提示有感染者。預后判斷標準依據患者出院時情況及在院死亡作為判斷節點，分為好轉及惡化[17]。（1）好轉：患者肝衰竭癥狀、體征基本消失或有明顯好轉，且肝功能指標明顯好轉（血清膽紅素以及谷丙轉氨酶降低50%以上）;（2）惡化：癥狀、體征均無好轉，甚至出現病情惡化及臟器衰竭等生命體征不穩定表現，或者醫治無效死亡。

1.3? 納入標準

（1）符合乙肝相關性慢性肝病基礎上導致的HBV-ACLF診斷標準;（2）年齡18～65歲;（3）患者病歷資料全面者;（4）入組患者皆自愿參加，并簽署知情同意書。

1.4? 排除標準

（1）乙肝相關性慢性肝病基礎上合并其他病因如甲肝、戊肝、丙肝、EB病毒、巨細胞病毒及自身免疫性肝病、藥物性肝損傷等導致的肝衰竭;（2）合并有某些致死性并發癥如腦水腫、消化道大出血等;（3）合并真菌感染者;（4）妊娠或哺乳期婦女;（5）合并原發性肝癌或其他腫瘤者;（6）近3月服用免疫抑制劑、激素者。

1.5? 觀察指標

1.5.1? 外周血Treg、Th17細胞計數? 采用美國BD公司C6型流式細胞儀檢測外周血Treg、Th17細胞計數，取患者外周血約2 mL分離單個核細胞后，依次進行細胞刺激活化、表面標記染色、固定破膜等，具體檢測方式參照CD4、CD25、IL-17A、Foxp3試劑盒，試劑盒均購自美國BD公司，批號分別為555346、555432、560486、560045。

1.5.2? 炎癥因子IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-17A、IL-23的表達? 取患者空腹外周血約2 mL，分離留取上清液，采用美國BD公司C6型流式細胞儀，用細胞因子微球檢測技術檢測炎癥因子IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-17A、IL-23的表達，具體檢測方式參照IL-17A、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-23試劑盒，試劑盒均購自美國BD公司，批號分別為560383、560112、560429、558274、558245。

1.5.3? 實時熒光定量PCR檢測轉錄因子Foxp3、ROR-γt mRNA水平? 采用美國Applied Biosystems公司7500型熒光定量PCR儀檢測外周血Treg、Th17細胞相關轉錄因子Foxp3、ROR-γt mRNA表達，具體檢測方式參照ROR-γt、Foxp3多克隆抗體試劑盒，試劑盒均購自美國ABclonal公司，批號分別為A10240、A8024。基因的引物由GENELIFE公司利用Primer Express 2.0軟件設計，上海Sangon公司合成完成。內參β-Actin引物序列：正向引物序列為GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC，反向引物序列為GCGGATGTCCACGTCACACTTC，長度為93 bp。Foxp3引物序列：正向引物序列為AAGAACGCCATCCGCCACAAC，反向引物序列為TCCAGCTCATCCACGGTCCAC，長度為92 bp。ROR-γt引物序列：正向引物序列為AGCGGCAACAGCAGCAACAG，反向引物序列為CAGGCAGGTCAGGCGAGGAG，長度為132 bp。

1.5.4? 酶聯免疫吸附試驗檢測CRP、PCT及鱟試劑法檢測內毒素（lipopolysaccharide， LPS）水平? 采用德國Roche Diagnostics Gmbh公司cobas 8000和cobas e 411型電化學發光全自動免疫分析儀分別檢測CRP、PCT的表達，具體操作步驟參照試劑盒操作說明書進行，試劑盒購自羅氏診斷公司，批號分別為20152401562、20162404451。采用湛江博康海洋生物公司BET-24A型細菌內毒素分析儀以鱟試劑法檢測LPS表達，具體操作步驟參照說明書進行，試劑盒購自湛江博康海洋生物公司，批號為17051014。

1.6&nbsp; 統計學方法

所有數據采用SPSS 25.0軟件進行數據統計處理。計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗;等級資料行秩和檢驗;計量資料以“x±s”表示，進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，符合正態性分布和方差齊性釆用獨立樣本t檢驗，不符合正態性分布和方差齊性，采用兩個獨立樣本非參數檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 兩組患者CRP、PCT、LPS水平

有細菌感染組CRP、PCT、LPS水平均明顯高于無細菌感染組（P<0.01，P<0.05）。見表1。

2.2? 兩組患者Treg、Th17細胞計數

有細菌感染組Treg細胞計數與無細菌感染組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。有細菌感染組Th17細胞計數明顯高于無細菌感染組（P<0.01）。見表2、圖1-2。

2.3? 兩組患者IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-17A、IL-23表達

兩組TGF-β表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。有細菌感染組IL-10表達明顯低于無細菌感染組（P<0.05）;有細菌感染組Th17細胞相關細胞因子TNF-α、IL-17A、IL-23表達均明顯高于無細菌感染組（P<0.01，P<0.05）。見表3。

2.4? 兩組患者Foxp3、ROR-γt mRNA表達

有細菌感染組Foxp3 mRNA表達低于無細菌感染組（P<0.01），有細菌感染組ROR-γt mRNA表達高于無細菌感染組（P<0.01）。見表4。

2.5? 兩組患者預后

有細菌感染組惡化率（83.33%）顯著高于無細菌感染組（11.11%）（P<0.01）。見表5。

3 討論

感染作為ACLF急性事件之一，是其發展過程中導致病情加重甚至死亡最常見的原因之一[18]，本研究中合并感染患者占43.75%，這與國內外多數研究占30%～50%基本相符。隨著肝衰竭病程進展，機體在依次經受早、中期階段病毒介導的免疫炎癥反應調節作用和晚期階段LPS介導的炎癥反應調節作用后，自身防御機制受損加重，由于肝內網狀內皮系統受損，巨噬細胞功能下降，白細胞黏附、趨化及吞噬功能降低、補體合成不足，導致機體對細菌的易感性增加，出現炎癥免疫損傷[19]。而且ACLF晚期患者由于腸壁瘀血水腫、缺血缺氧，加上氧化應激、炎癥趨化因子等使腸黏膜損傷造成腸道機械屏障、生物、化學及免疫等屏障障礙，出現“腸泄漏現象”，腸源性內毒素血癥的發生率高達93.3%～100%，這種“LPS-巨噬細胞-細胞因子風暴”機制的啟動是患者發生內源性感染的主要內在因素，在此過程中大量炎癥介質瀑布樣釋放入血，而機體相應的內源性炎癥拮抗機制未作出有效應對，最終導致全身炎癥反應綜合征甚至多器官功能衰竭[20]。同時隨著肝衰竭進展，內源性抗炎介質大量釋放，引起代償性抗炎癥反應綜合征，大量炎癥因子消耗與抗炎因子釋放，最終導致免疫麻痹發生，從而加劇了各種感染的易感性[21]，其中以自發性腹膜炎最為常見，其次為腸道感染、肺部感染、膽道感染、尿路感染等[16]，是ALCF患者死亡的獨立危險因素[22]。

正如中醫學的正氣學說，肝主疏泄，主藏血，為調節氣血的場所和樞紐，它的生理結構和特性使疫病之毒更易入血，乙肝病毒性肝炎相關的慢加急性肝衰竭就是屬中醫學“疫毒內伏血分”范疇。伏邪發病，正虛是必要條件，也就是說在機體正氣不足為本，即免疫失衡的情況下伏邪易于暴發。而HBV-ACLF患者屬于臨床危重病證，邪氣盛而正氣虧損嚴重，“邪之所湊其氣必虛”，細菌則好比“伏邪”，當機體正虛時伺機引發感染，因此治療上也強調細菌感染虛注意固扶正氣，正氣足則邪不可干，從而避免新生內生之邪，使得感染復雜化。

課題組前期實驗已發現Treg/Th17細胞與內毒素血癥二者有著密切復雜的關系，二者在肝衰竭患者病程發展中發揮重要的作用，機體合并細菌感染后，Th17細胞在相關因子的刺激下增值分化，通過分泌相關炎癥細胞因子、趨化因子、集落刺激因子如TNF-α、IL-17A、IL-23等從而誘導單核/巨噬細胞、內皮細胞向病灶內轉移，促進免疫反應，進而加重炎癥反應;而Treg細胞呈現一種負反饋調節作用，通過增值分化能抑制過強的免疫反應以減輕炎癥損傷，但不足以抗衡Th17所介導的炎癥反應，因此，在感染狀態下，其相關抑炎因子IL-10、TGF-β反而呈下調趨勢[23-24]。但是，ROR-γt和Foxp3分別作為Th17和Treg細胞的特異性轉錄因子，研究結果發現合并細菌感染的肝衰竭患者ROR-γt mRNA表達與Th17細胞計數皆上升;而Foxp3 mRNA表達下降，與Treg細胞計數趨勢相反。由此，我們推測在合并有細菌感染的條件下，Treg細胞可以使Foxp3的表達下調，從而削弱其抑制Th17介導下的免疫炎癥反應的功能[25]，而導致這種現象出現的關鍵因素是機體中高水平的炎性細胞因子，在這種炎癥性內環境里許多前炎性細胞因子能明顯降低Treg細胞的功能而導致其功能的缺陷，不能有效抑制炎癥反應。這種Treg/Th17細胞免疫平衡關系與肝衰竭細菌易感性的聯系，正是中醫學正邪相爭致病之理，充分了解其病程中Th17/Treg失衡偏移的方向及炎癥反應也有利于為中醫辨證分析提供一個客觀化實驗指標，更大程度上發揮中醫藥干預治療疾病的優勢作用。

因此，本研究中通過觀察比較HBV-ACLF合并與未合并細菌感染患者Treg/Th17細胞及相關細胞因子的表達變化，發現合并細菌感染患者Th17細胞及相關因子TNF-α、IL-17A、IL-23及其特異性轉錄因子ROR-γt的表達明顯高于無細菌感染患者（P<0.05，P<0.01），提示在HBV-ACLF整個發病過程中存在Th17細胞優勢化現象，其表達水平在一定程度上反應了機體的免疫功能狀態，且與HBV-ACLF合并感染患者的預后密切相關，具體機制可能與Th17細胞過度增值分化介導炎癥級聯反應導致炎癥反應失控，加重肝組織炎癥反應相關。通過干預促進恢復Treg/Th17細胞的動態平衡，降低炎癥因子表達，改善肝衰竭患者炎癥反應失衡狀態，可有望降低感染事件發生，為肝衰竭治療提供全新視角和思路。

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