基于TCGA 數據庫分析HPRT1 在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

張詩晗，張健

（天津醫科大學口腔醫院口腔頜面外科，天津 300070）

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是口腔最常見的惡性腫瘤，約占口腔癌總數的90%，其發病率呈上升趨勢[1-2]。OSCC 可發生在舌、頰、牙齦、硬腭、口底等黏膜部位。OSCC 的病因尚不清楚，多數研究表明吸煙、飲酒、咀嚼檳榔、人乳頭瘤病毒（HPV，主要是16 型）、硬皮病、某些遺傳病（如Zinsser- Engman -Cole 綜合征等）可能是口腔癌發生的危險因素。OSCC 浸潤性強，易出現淋巴結轉移，通常在晚期后才被診斷出來，5年生存率不到50%[3]。目前已有一些研究探討了影響OSCC 發展和預后的一些相關因子，以尋找新的治療靶點，為OSCC 基因靶向治療提供了新方向[4]。

次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1）又稱為HPRT、HGPRT。它是一種補救途徑酶，負責將核糖單磷酸從磷酸核糖焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP）轉移到次黃嘌呤和鳥嘌呤，分別形成肌苷單磷酸（inosine monophosphate，IMP）和鳥苷單磷酸（guanosine monophosphate，GMP）[5]。HPRT1含有217個氨基酸，在所有組織中均以低水平表達[6]，唯一的例外是在中樞神經組織中表達水平異常升高[7]。最近一些研究發現，HPRT1 在惡性腫瘤組織中的表達普遍升高。有學者發現HPRT1 的mRNA 水平與受試小鼠的腫瘤負荷直接相關，說明小鼠體內HPRT1 的水平與腫瘤的大小有關[8]。研究表明，HPRT1 的表達在前列腺癌患者樣本中增加，在乳腺癌患者的基礎亞型中最高，并與乳腺癌的進展相關，可作為一個潛在的預后標志物[9]。對結腸、直腸癌的研究表明，與正常組織相比，腫瘤樣本中HPRT1 的水平升高[10]。最新研究發現，HPRT 通過與信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）的直接相互作用，促進頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的增殖和轉移[11]。也有學者證實HPRT1在HNSCC 組織中的高表達與患者的不良預后有關[12]。目前國內對于HPRT1 在OSCC 中的作用鮮有報道，因此本研究擬利用TCGA 數據庫網站分析HPRT1在OSCC 中的表達及意義。有文獻報道嘌呤水平顯著降低了癌癥中的免疫細胞活化，惡性腫瘤組織中HPRT1的上調是免疫抑制微環境的一個促成因素[13]。因此本研究對HPRT1 在OSCC 免疫環境中的作用也做了相應研究。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數據收集 從TCGA 數據庫（https：//can cergenome.nih.gov/）中下載OSCC 轉錄樣本394 例（其中362 例癌癥樣本，32 例癌旁樣本）和臨床數據（381 例）。

1.2 研究方法

1.2.1 GESA 富集分析 GESA4.1.0 軟件富集分析HPRT1 表達水平與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路基因集的相關性。從MsigDB 數據庫中下載通路富集常用的c2.cp.kegg.v7.2.symbols 基因集作為參照基因集。軟件參數設置為隨機組合次數為1 000 次，計算富集系數和標準化后的富集系數。按照錯誤發現率（false discovery rates，FDR）進行排序，利用HPRT1 基因表達的中位數值將TCGA 數據集中的381 例OSCC 患者分為高表達組和低表達組，分別篩選出前十條通路。

1.2.2 免疫差異性與相關性分析 使用R4.1.1 軟件的“limma”包和“vioplot”包對免疫細胞在HPRT1高低表達組中的差異性進行分析和繪圖；使用“limma”包、“ggplot2”包、“ggpubr”包和“ggExtra”包對HPRT1 的表達量與免疫細胞的相關性進行分析和繪圖。

1.3 統計學處理 利用R4.1.1 軟件進行數據分析。利用Wilcoxon 法和Kruskal-Wallis 法進行臨床相關性分析。利用Log-Rank 法進行生存評估分析。生存資料中不同變量的風險比采用Cox 回歸分析。因TCGA 數據庫中OSCC 患者臨床數據中M 分期未知的數據過多，導致刪除臨床信息不完整的數據后樣本量過小，因此在進行臨床相關性分析和Cox 分析時未將M 分期納入其中。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OSCC 和正常組織中HPRT1 的表達差異 TCGA數據庫中OSCC 組織與正常組織樣本相比，OSCC組織中HPRT1 表達水平明顯高于正常組織（t=1.856，P<0.001，圖1、2）。

圖1 總樣本中HPRT1 的表達差異Fig 1 Expression difference of HPRT1 in total samples

圖2 配對樣本中HPRT1 的表達差異Fig 2 Expression difference of HPRT1 in paired samples

2.2 HPRT1 基因與OSCC 患者臨床特征的相關性 HPRT1 表達水平在腫瘤分級中的G1 和G2 級（χ2=0.010，P=0.011）、G1 和G3 級（χ2=0.806，P< 0.001）以及G2 和G3 級（χ2=0.001，P=0.047）差異有統計學意義（圖3）；在腫瘤臨床分期中的Ⅰ期和Ⅲ期（χ2=0.078，P=0.006）、Ⅲ期和Ⅳ期（χ2=0.091，P=0.038）差異有統計學意義（圖4）；在T 分期中的T1 期和T3期（χ2=0.342，P=0.037）差異有統計學意義（圖5）。HPRT1 表達水平與年齡、性別、N 分期差異無統計學意義（圖6~8）。

圖3 HPRT1 與腫瘤分級的關系Fig 3 Relationship between HPRT1 and tumor grade

圖4 HPRT1 與臨床分期的關系Fig 4 Relationship between HPRT1 and clinical stage

圖5 HPRT1 與腫瘤T 分期的關系Fig 5 Relationship between HPRT1 and tumor T stage

圖6 HPRT1 與年齡的關系Fig 6 Relationship between HPRT1 and age

圖7 HPRT1 與性別的關系Fig 7 Relationship between HPRT1 and gender

圖8 HPRT1 與腫瘤N 分期的關系Fig 8 Relationship between HPRT1 and tumor N stage

2.3 HPRT1 基因表達與患者生存率的關系 TCGA 數據庫中381 例患者的隨訪時間為0.07 個月至15 年，HPRT1 基因高表達組總生存率明顯低于低表達組（圖9，P＜0.05）。高表達組5 年生存率為35.2%，低表達組5 年生存率為50.3%。

圖9 HPRT1 與患者生存率的關系Fig 9 Relationship between HPRT1 and patients'survival rate

2.4 HPRT1 基因與OSCC 患者預后的關系 Cox 單因素分析顯示OSCC 中年齡（HR=1.03，P= 0.001）、腫瘤分級（HR=1.38，P=0.031）、腫瘤分期（HR=1.74，P＜0.001）、T 分期（HR=1.54，P＜0.001）、N 分期（HR=1.50，P＜0.001）、HPRT1 表達量（HR=1.03，P＜0.001）與患者的生存預后相關（表1）。Cox 多因素分析顯示OSCC 中年齡（HR=1.03，P＜0.001）和HPRT1 表達量（HR=1.02，P=0.002）與患者生存預后相關。因此年齡和HPRT1 的高表達是影響OSCC 患者預后的獨立因素（表1、圖10）。

表1 Cox 單因素及多因素分析Tab 1 Cox single factor and multi factor analysis

圖10 HPRT1 的Cox 多因素分析結果Fig 10 Cox multivariate analysis results of HPRT1

2.5 HPRT1 可能參與的信號通路 GSEA 結果顯示，HPRT1 基因高表達樣本主要富集在基礎轉錄因子通路、細胞周期通路、DNA 復制等通路（FDR＜0.05，P＜0.05）；HPRT1 基因低表達樣本主要富集在氨酰-tRNA 生物合成通路、堿基切除修復通路（P＜0.05）（圖11、12）。

圖11 HPRT1 基因高表達組的GSEA 富集結果Fig 11 GSEA enrichment results of HPRT1 gene high expression group

2.6 HPRT1 與免疫細胞的相關性

2.6.1 免疫細胞差異分析 幼稚B 細胞（P=0.048）、調節性T 細胞（P=0.001）、休眠NK 細胞（P=0.029）、休眠肥大細胞（P＜0.001）、活躍肥大細胞（P=0.047）、嗜酸性粒細胞（P=0.035）、中性粒細胞（P=0.016）的表達在HPRT1 高表達組與低表達組中的差異有統計學意義（圖13）。

圖13 免疫細胞在兩組患者中的表達Fig 13 Expression of immune cells in two groups of patients

2.6.2 免疫細胞相關性檢驗 調節性T 細胞（R＜0，P＜0.001）、休眠肥大細胞（R＜0，P=0.003）和中性粒細胞含量（R＜0，P=0.001）與HPRT1 表達量呈負相關；嗜酸性粒細胞含量（R＞0，P=0.016）與HPRT1 表達量呈正相關（圖14）。

圖12 HPRT1 基因低表達組的GSEA 富集結果Fig 12 GSEA enrichment results of HPRT1 gene in low expression group

圖14 HPRT1 與免疫細胞的相關性Fig 14 Correlation between HPRT1 and immune cells

3 討論

OSCC 是嚴重威脅人類健康的一類惡性腫瘤，它的典型特征是高度的局部侵襲性和淋巴結轉移，由于OSCC 易轉移、易復發，因此OSCC 患者的總體5年生存率仍不到50%[14]。目前OSCC 的發病機制尚不清楚，可能是由多基因、多通路聯合調控的復雜過程。尋找與OSCC 發展及預后的密切相關因子，對腫瘤的早期診斷與預后極其重要。本研究通過挖掘TCGA數據庫公開發表的基因表達數據，發現HPRT1 在OSCC 組織中高度表達，對腫瘤內的免疫環境產生了影響，并且高表達患者的生存預后更差，提示HPRT1 可能是OSCC 的一個潛在的預后因子。

HPRT1 是一種蛋白質，已顯示在多種腫瘤類型中顯著升高[8-10]，HPRT1 在神經發育和嘌呤合成中具有次要調節作用，嘌呤過剩分解與HPRT1 功能的喪失直接相關[15]。HPRT1 在腫瘤中的表達普遍升高，說明HPRT1 在腫瘤中的調節作用可能是獨特的，HPRT1 的異常調節可能會增強細胞增殖并促進腫瘤發展。腫瘤微環境不僅由惡性細胞組成，實質細胞、成纖維細胞、間充質細胞、血管、淋巴管和免疫細胞之間存在復雜的相互作用，它們結合起來形成復雜的腫瘤微環境[16]。本研究顯示HPRT1 升高會影響調節性T 細胞（Tregs）、休眠肥大細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的含量，因此HPRT1 可能對腫瘤微環境中的細胞因子表達有影響。有學者研究HPRT1在幾種腫瘤中的免疫浸潤發現，HPRT1 表達與B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的免疫浸潤之間存在顯著的負相關；在前列腺腺癌（PRAD）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）和甲狀腺癌（THCA）中，HPRT1 升高后所有類型的免疫細胞的腫瘤浸潤減少，但THCA 中的CD8+T 細胞除外；而HPRT1 升高后免疫浸潤幾乎沒有變化的是食道癌（ESCA）、腎嫌色細胞癌（KICH）和子宮癌肉瘤（UCS）[13]。Tregs 在維持自身耐受和免疫穩態方面發揮重要作用，但它們參與促進了腫瘤周圍的免疫抑制環境[17]，而腫瘤微環境也促進了Tregs 的積累[18]。Tregs 可以高度浸潤各種腫瘤類型（如皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌等），在晚期腫瘤（Ⅲ期和Ⅳ期）經常表現出更高的積累[18]。有報道指出腫瘤內Tregs 的浸潤與生存率呈負相關[19]。而本研究發現HPRT1 的高表達與Tregs 的含量呈負相關，并且在3 種與HPRT1 表達呈負相關的免疫細胞中差異最大，推測HPRT1 的表達對Tregs 在腫瘤微環境中的產生與積累密切相關，關于HPRT1 與Tregs 在腫瘤微環境中表達的機制還有待進一步探究。休眠肥大細胞是與軟組織肉瘤的復發和生存率相關的免疫細胞[20]，并與透明細胞腎細胞癌（ccRCC）的良好預后有關，盡管其在ccRCC 中的含量較低[21]。本研究發現休眠肥大細胞在HPRT1 高低表達組中含量差異最大，表明HPRT1高表達可能抑制休眠肥大細胞產生。腫瘤相關的中性粒細胞增多是黑色素瘤、胃癌、肺癌、頭頸癌等的不良預后特征[22]。有學者發現CD16（high）CD62L（dim）中性粒細胞的增加與頭頸癌的良好預后相關[23]。本研究發現中性粒細胞隨HPRT1表達增高而減少，關于中性粒細胞在OSCC 中的作用還有待證實。嗜酸性粒細胞可分泌多種可溶性介質和效應分子，它們對腫瘤微環境中其他免疫細胞亞群具有調節功能，或對腫瘤細胞具有直接的細胞毒性功能，而產生抗腫瘤或促腫瘤作用[24]。在以腫瘤相關組織嗜酸性粒細胞增多（TATE）為特征的致癌物誘導的倉鼠OSCC模型，用抗白細胞介素-5 單克隆抗體治療，可抑制腫瘤生長，嗜酸性粒細胞可能具有促腫瘤作用[25]。而本研究發現HPRT1 的高表達與嗜酸性粒細胞含量正相關，嗜酸性粒細胞在OSCC 中可能具有促腫瘤作用。HPRT1 參與嘌呤調節和產生，HPRT1 升高會產生更多的嘌呤。實質性腫瘤微環境可表現為缺氧，而嘌呤對缺氧條件下免疫細胞活化有顯著影響，因此這也可能是HPRT1 對腫瘤微環境的作用之一。HPRT1 在調節細胞周期中起重要作用，其參與的基礎轉錄因子通路、細胞周期通路、DNA 復制等通路可能對OSCC 預后也有影響。盡管本研究確定了OSCC 中HPRT1 基因的表達水平增加，但這種現象的潛在機制仍不清楚，還需更深入的探討。

綜上所述，本研究結果表明HPRT1 過表達與OSCC 的進展顯著相關。腫瘤組織中HPRT1 表達的上調可能是OSCC 診斷、預后和靶向治療的生物標志物。然而，必須進行進一步的調查和臨床試驗來闡明HPRT1 在OSCC 中的作用機制。