尿液中miRNA-24-3p 聯合miRNA-222-3p 檢測在前列腺癌中的診斷及臨床意義

任超

（1.天津醫科大學人民醫院臨床學院，天津 300121；2.天津市濱海新區大港醫院檢驗科，天津 300270）

前列腺癌是男性第二常見的惡性腫瘤，也是第五大致死癌癥。目前，血清前列腺特異性抗原（PSA）水平升高（≥10 ng/mL）和（或）可疑直腸指檢（DRE）進行前列腺活檢和組織病理學評估，可對前列腺癌做出診斷[2]。但PSA 對前列腺癌的特異性較低，導致許多不必要的前列腺活檢和前列腺癌的過度治療[3]。因此，迫切需要一種新的無創性分子生物標志物來準確診斷前列腺癌并預測其預后，以提高臨床診斷水平及做出治療決定。MicroRNAs（miRNAs）是一類小的非編碼RNA[4]，已發現超過2 500 個成熟的miRNA[5]，每個miRNA 都有可能調控數百個基因[6]，miRNAs 因其檢測的穩定性好，被認為是很好的生物標志物。研究表明，前列腺癌患者組織和血液（血清/血漿）樣本中的miRNAs 表達發生改變，可作為前列腺癌分期或診斷、預后的標志分子[7-10]。miRNA-24 與miRNA-223、-375 表達差異的變化聯合可作為前列腺癌患者的診斷分子標志物[11]。此外，miRNA-222-3p 可能通過負調控SNAP91 的表達在轉移性前列腺癌中發揮重要作用[12]，但其是否可作為前列腺癌診斷或預后的標志分子尚無報道。本研究聯合檢測miRNAs 在不同前列腺癌分期患者尿液中的表達。通過進一步分析差異表達的miRNAs，尋找穩定、可靠的前列腺癌診斷標志分子，同時通過比較不同Gleason 分級組間的表達差異，以期改善前列腺癌的危險分層，指導個性化的治療決策。

1 對象及方法

1.1 研究對象及分組 收集2016 年1 月—2021 年12 月在天津市濱海新區大港醫院檢驗科因排尿困難、尿失禁等臨床癥狀接受檢查且PSA（4～25 ng/mL）中度升高患者的尿液和血清，初步進行miRNAs 芯片篩選組的樣本分為兩組：對照1 組（6 例良性前列腺增生患者）及PC1組（18 例，根據Gleason 評分進一步分為3 組，即GS16 組、GS17 組、GS18 組，各6 例）。另外，miRNAs 表達驗證時樣本組分為4 組：對照2組（20 例良性前列腺增生患者），PC2組59 例，PC2組根據Gleason 評分進一步分為3 組：GS26 組22例，GS27 組19 例及GS28 組18 例。PC 組患者納入標準：經病理切片證實；首次診斷。排除標準：他處具有原發性腫瘤；術前具有放化療治療；不配合試驗者。所有受試者在參加本研究之前均知情同意。

1.2 miRNA 提取及逆轉錄 收集的血清和首次排尿樣本最初儲存在4℃，在6 h 內將其等分并轉移至-80℃冰箱儲存。所有患者均行經直腸超聲引導活檢。用差速離心法從38.5 mL 的尿液獲得無細胞尿液，在4℃，13 000 ×g 離心10 min，去上清以去除碎屑和鹽。進一步將上清液超速離心13 000×g，10 min，最終獲得的顆粒再用250 μL PBS 懸浮，然后儲存在-80℃供以后使用。患者血清在30℃靜置10 min，去除剩余細胞和細胞碎片。在13 000×g，10 min 進一步超速離心上清液后并用PBS 洗滌，重復兩次，最終獲得的顆粒100 μL PBS 再懸浮，然后儲存在-80℃供以后使用。用miRNeasy 小試劑盒（Qiagen，Venlo，Netherlands）和凈化試劑盒（Qiagen）分離miRNA 和mRNA，Nanodrop 紫外吸收測定法測定RNA 在波長260 nm 和280 nm 的吸收值，獲得RNA 的濃度并通過A260/280 及A260/230 的吸收比值判斷RNA 的純度。

1.3 人類miRNA 芯片檢測miRNA 表達水平 利用人類miRNA Microarray，Release 21.0（G4872A，Agilent）芯片檢測技術，制備熒光標記探針，miRNA 3′端進行Cy 熒光標記，采用SurePrint 原位噴墨合成技術合成60-mer 用于與芯片雜交的熒光探針。芯片雜交，取約100 ng 量的質檢達標樣本，與miRNA 芯片進行雜交，檢測miRNA 的表達。

1.4 qRT-PCR 驗證候選miRNA 標志分子的表達水平 利用Arraystar SYBR? Green qPCR Master Mix（ROX-）（AS-MR-005-5，康成生物）進一步驗證miRNA 的表達水平，反應體系為：樣本200 ng（2 μL），上下游引物（10 μmol/L，1.5 μL），SYBR? Green（10 μL），DERC 水（6.5 μL）。反應程序為：95℃20 s，隨之進行40 個循環：95℃10 s，60℃20 s，70℃10 s，并在7900 real-time PCR 儀上進行檢測。以穩定表達的miRNA-200b-3p，miRNA-27b-3p 做內參[13]。引物序列如下：miRNA-200b-3p：上游：5′-GCTGCTGAATTCCATCTAATTTCCAAAAG-′；下游：5′-TATTATGGATCCGCCCCCAGGGCAATGGG-3′；miRNA-27b-3p：上游：5′-AGCGTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-TCCTCCTCTCCTCTCCTCTC-3′；miRNA-24-3p：上游：5′-ACAGCAGGCACAGAGAGGGG-3′，下 游：5′-CTGGCTCAGTTCAGCAGG AACAG-3′；miRNA-222-3p；上游：5′-GGGGAGCTACAT CTGGCT-3′，下游：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。miRNAs 表達量計算公式為：差異倍數=2-（△△Ct），其中△Ct=Ct（miRNA）-Ct（miR-200b-3p，miR-27b-3p），△△Ct=△Ct（病例組）-△Ct（對照組）

1.5 統計學處理 利用SPSS 16.0 軟件進行Student t 檢驗用以組間差異統計學分析，正態分布的計量資料用±s 表示。計量資料采用n（%）表示，頻數小于5 的數據采用Fisher 精確概率法。繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），計算曲線下面積（AUC）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿液中miRNAs 差異表達 針對miRNAs 篩選組樣本進行miRNA 芯片檢測（表1），結果發現，與對照1 組相比，PC1組（包括GS16、GS17、GS18組）年齡差異均無統計學意義（P＜0.05）；GS18 組PSA≥10 ng/mL 者的例數更多（P＝0.03）。與對照1 組相比，各miRNAs 均一化表達量（1±0.07），共有20 個miRNAs表達發生顯著差異性改變，其中11 種miRNAs 顯著性下調，9 種miRNAs 顯著性上調（表2），其中，表達差異最為顯著的兩個miRNAs：miRNA-24-3p（-2.58±0.022）及miRNA-222-3p（-2.89±0.029）表達比對照1 組顯著下調。

表1 臨床樣本信息表[±s，n（%）]Tab 1 Clinical sample information form[±s，n（%）]

表1 臨床樣本信息表[±s，n（%）]Tab 1 Clinical sample information form[±s，n（%）]

注：GS：Gleason 評分；PC：前列腺癌；PSA：血清前列腺特異性抗原

組別 年齡（歲） PSA（＜10 ng/mL）PSA（≥10 ng/mL） GS對照1 組（n=6） 65.5±1.5 6（100） 0（0）PC1 組GS16（n=6） 66.4±1.2 5（83） 1（17） 3+3 GS17（n=6） 74.0±2.3 3（50） 3（50） 3+4 GS18（n=6） 78.2±2.5 1（17） 5（83）a 4+4 χ2/F 10.61 10.27 21.56 P 0.09 0.07 0.03

2.2 RT-PCR 驗證差異miRNA 的表達水平 利用RT-PCR 在驗證樣本組（表3）中進一步驗證這些差異miRNAs 基因的表達水平，結果提示，與對照2 組相比，GS27 組miRNA-24-3p 顯著下調，與GS27 組相比，GS28 組miRNA-24-3p 顯著下調。與對照2組相比，PC2 組中miR-222-3p 都顯著下調。與GS26 組、GS27 組相比組，GS28 組顯著下調（圖1）。

圖1 RT-PCR 驗證各組尿液樣本中miRNAs 表達水平Fig 1 Validation of miRNAs expression levels in urine samples by RT-PCR

表3 驗證miRNAs 表達的樣本信息[±s，n（%）]Tab 3 Samples clinical characteristics for miRNAs expression validation[±s，n（%）]

表3 驗證miRNAs 表達的樣本信息[±s，n（%）]Tab 3 Samples clinical characteristics for miRNAs expression validation[±s，n（%）]

注：GS：Gleason 評分；PC：前列腺癌；PSA：血清前列腺特異性抗原

組別 年齡（歲）PSA（＜10 ng/mL）PSA（≥10 ng/mL） GS對照2 組（n=20） 62.5±0.5 20（100） 0（0）PC2 組GS26（n=22） 65.5±1.5 18（82） 4（18） 3+3 GS27（n=19） 68.6±2.2 6（33） 13（67） 3+4 GS28（n=18） 80.5±3.4 1（5） 17（95） 4+4 χ2/F 6.43 11.45 19.01 P 0.04 0.07 0.04

在血清樣本中，利用RT-PCR 進一步檢測差異miRNAs 基因的表達水平，結果表明，與對照2 組相比，GS28 組miRNA-24-3p 及miR-222-3p 顯著下調（圖2）。根據miRNA-24-3p 及miRNA-222-3p 作為聯合診斷指標繪制ROC 曲線。如圖3 所示，AUC值為0.93（OR=1.37，95% CI：0.92~1.76，P＝0.02），提示miRNA-24-3p 及miRNA-222-3p 表達量改變聯合診斷前列腺癌的應用價值較高。

圖2 RT-PCR 驗證各組血清樣本中miRNAs 表達水平Fig 2 Validation of miRNAs expression levels in serum samples by RT-PCR

圖3 miRNA-24-3p 及miRNA-222-3p 聯合診斷前列腺癌的受試者工作特征曲線Fig 3 Receiver operating characteristic curve of the combination of miRNA-24-3p and miRNA-222-3p model as diagnostic subjects for prostate cancer

3 討論

本研究在篩選階段，篩選到20 個差異表達的miRNAs 后，進行了第二階段的驗證，最終鑒定出2種穩定下調的尿液、血清miRNAs（miR-24a-3p、miR-222-3p），同時比較不同GS 其表達差異，證明其在前列腺癌診斷及GS 危險分層中具有較高的準確性，可能成為未來前列腺癌診斷的分子特征。

迄今為止，越來越多miRNAs 被認為可作為前列腺癌診斷、分級、預后的標志分子。2017 年，丹麥奧胡斯大學醫院研究團隊針對第一組樣本：20 例良性前列腺增生（BPH）及188 例前列腺癌患者的無細胞尿液，應用qRT-PCR 檢測92 種miRNAs 的表達水平，結果顯示，相比BPH 組，前列腺癌組14 種miRNAs 表達水平顯著升高，30 種miRNAs 表達水平顯著下降。進一步在第二組樣本：20 例BPH 及197 例前列腺癌患者中，檢測該92 種miRNAs 的表達水平，發現在前列腺癌組中，有6 種miRNAs 表達水平顯著升高，22 種miRNAs 表達水平顯著下降。合并分析兩組樣本中存在表達差異的miRNAs，篩選到miRNA-222-3p、miRNA-24-3p 及miRNA-30c-5p 這一差異表達的miRNAs 組合，在第一組中鑒別診斷前列腺癌的準確率達95%，在第二組中診斷前列腺癌準確率為89%。且在PSA＜15 ng/mL 的患者中，對第一組及第二組樣本隊列中前列腺癌組的確診率也可高達97%與89%，提示該miRNAs 組合可作為前列腺癌患者早期診斷的標志物[10]。在該組合中，miRNA-222-3p、miRNA-24-3p 在前列腺癌組中顯著下調，而miRNA-30c-5p 則顯著上調。該研究團隊于2019 年，利用類似的方法分析得到包含miRNA-151a-5p、miRNA-204-5p、miRNA-222-3p、miRNA-23b-3p 和miRNA-331-3p 的組合多標志物模型，該模型與前列腺癌根治性手術后是否生化復發，及前列腺癌患者的危險分級顯著相關[14]。日本大阪大學醫學研究院研究團隊于2021 年針對PSA 水平升高的直腸指檢陽性患者及陰性患者尿液細胞外小泡，進行芯片檢測分析miRNAs 表達水平，發現miRNA-30b-3p 和miRNA-126-3p 在前列腺癌患者中顯著高表達，其預測前列腺癌發生的敏感性和特異性分別為46.4%和88.0%、60.7%和80.0%，優于血清PSA（分別為53.5%和64.0%），可作為預測前列腺癌的分子標志物[7]。同年，韓國一項研究對149例前列腺癌患者尿液外體miRNA 表達譜進行鑒定，發現miRNA-21、miRNA-16、miRNA-142-3p、miRNA-451 在前列腺癌中表達顯著上調，而miRNA-636 顯著下調。當綜合評估臨床因素時，miRNA-21、miRNA-451、miRNA-636，及術前PSA 水平在多因素分析中仍有顯著性差異。在此基礎上，該研究團隊建立了前列腺癌轉移風險評分（PCa-MRS）模型。PCa-MRS 顯示出優于術前PSA 或臨床GS 的分層能力（AUC=0.925）。得分高的患者生化無復發生存率明顯低于得分低的患者[8]。此外，揚州大學研究團隊檢測前列腺癌患者及正常對照組外周血血清中168 種miRNAs，發現miRNA-146a-5p、miRNA-24-3p 及miRNA-93-5p 水平顯著升高，可作為前列腺癌患者無創性診斷標志物[15]。

本研究提出miRNA-24-3p 可作為前列腺癌患者鑒定標志分子，其機制被認為是通過調節細胞因子通路，進而影響前列腺癌細胞的遷移、侵襲、增殖[16]。另有研究發現，miRNA-24-3p 可通過調控fascin1（FSCN1），影響前列腺癌的耐藥性[17]。在高危的前列腺癌患者中，miRNA-222-3p 可靶向調控血管內皮生長因子受體2/KDR 蛋白[18]。但這兩種miRNAs具體的機制及是否存在協同靶向作用需進一步明確。

綜上所述，本課題組確定了一個用于前列腺癌診斷、分層的miRNA 組，今后將進一步在更大的樣本中驗證及統計，以期在未來的臨床中準確應用。