補(bǔ)充維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

龍汝沛 文育鋒 李文博 張 冉 汪玉琴

1 皖南醫(yī)學(xué)院，安徽省蕪湖市 241001； 2 安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院

步入21世紀(jì)，心血管病(Cardiovascular diseases，CVD)已成為我國(guó)乃至全世界人民健康的頭號(hào)殺手。《中國(guó)心血管病報(bào)告2017》報(bào)告指出，我國(guó)心血管類疾病因社會(huì)老齡化逐漸加重，居民普遍存在的不良生活方式如吸煙飲酒、身體活動(dòng)不足、不合理膳食等原因，患病率和死亡率都居高不下，而且在今后仍處不斷上升階段。據(jù)推算我國(guó)CVD 2018年患病人數(shù)達(dá)2.9億人，患病人數(shù)前四位依次為：高血壓、腦卒中、冠心病、肺源性心臟病。2015年CVD死亡率超過惡性腫瘤等其他人類疾病居于各類疾病首位，心血管疾病的三高，即高患病率、高死亡率以及極高的醫(yī)療負(fù)擔(dān)為我國(guó)疾病防治工作帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種以脂質(zhì)代謝障礙為病變基礎(chǔ)累及全身大小動(dòng)脈的疾病，其最突出的病理機(jī)制為動(dòng)脈粥樣斑塊附著于動(dòng)脈血管內(nèi)壁，使動(dòng)脈腔變狹窄，或繼發(fā)血栓形成阻塞血管，使相應(yīng)的器官供血不足甚至缺血壞死，從而引起全身性的疾病。

流調(diào)結(jié)果表明絕經(jīng)前后女性人群高血壓等心血管類疾病發(fā)病率有明顯的變化，絕經(jīng)前低于同年齡組的男性，但是絕經(jīng)后發(fā)病率飛速上升，甚至高于同年齡段的男性。絕經(jīng)后女性生理上最主要的改變是雌激素水平的顯著下降，研究顯示雌激素下降與心血管類疾病事件發(fā)生相關(guān)聯(lián)。維生素D是一種脂溶性維生素，人體所需的維生素D大多數(shù)通過光照作用機(jī)體自然合成，并且在較小程度上來源于天然含有維生素D的食物補(bǔ)充。有研究發(fā)現(xiàn)維生素D可通過一系列復(fù)雜的機(jī)制調(diào)節(jié)腎素—血管緊張素系統(tǒng)而影響血壓變化，而高血壓是CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。也有研究顯示維生素D與多種CVDS相關(guān)，維生素D受體廣泛存在于血管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞，且調(diào)節(jié)腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)產(chǎn)生積極影響，但是具體的機(jī)制仍不清楚。但臨床試驗(yàn)和流調(diào)結(jié)果顯示補(bǔ)充維生素D是否能預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化性疾病仍然存在較大爭(zhēng)議[2-4]。

在復(fù)制實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈粥樣硬化模型時(shí)，諸多試驗(yàn)表明高劑量維生素D能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈硬化模型的形成[5-7]。但低劑量加入維生素D是否能影響動(dòng)脈硬化的形成鮮有研究。本次實(shí)驗(yàn)通過研究低劑量補(bǔ)充維生素D對(duì)卵巢切除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)血液指標(biāo)的影響,為探索絕經(jīng)后婦女補(bǔ)充維生素D對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是否有影響尋找依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 于南京市玄武區(qū)諾伊特生物技術(shù)中心購(gòu)買42只3月齡SD未孕雌性大鼠,體重150～200g,平均體重(167.80±14.58)g，放于動(dòng)物房飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成對(duì)照組、卵巢切除組、維生素D組,每組14只。

1.2 藥物及試劑 維生素D膠囊型滴劑(蕪湖市中山大藥房)、食用油(蕪湖市歐尚超市)、注射用牛血清蛋白(BAS，南京市玄武區(qū)諾伊特生物技術(shù)中心)、高脂飼料(南京市玄武區(qū)諾伊特生物技術(shù)中心)、各血清指標(biāo)酶聯(lián)免疫試劑盒(合肥碧信生物科技有限公司)。

1.3 造模及給藥方法 對(duì)照組:行偽手術(shù)(從背部切口1cm暴露雙側(cè)卵巢[8],不予摘除,雙側(cè)縫合注射青霉素抗感染)和普通飲食，灌胃生理鹽水2.5ml/d；卵巢切除組、維生素D組大鼠從背部切口摘除雙側(cè)卵巢形成去勢(shì)模型。去勢(shì)手術(shù)恢復(fù)1周后一次性注射牛血清蛋白(BSA)250mg/kg。之后卵巢切除組、維生素D組給予高脂飼料飼養(yǎng)10周。卵巢切除組每日灌服生理鹽水2.5ml,維生素D組取VitD 15IU溶于2.5ml食用油灌喂。

1.4 標(biāo)本采集 為得到可靠血脂相關(guān)指標(biāo)，大鼠先禁食12h后麻醉,剖開腹腔,用一次性注射器取腹主動(dòng)脈血,裝于試管中,分組做好標(biāo)記,靜置15min，3 000r/min高速離心法分離，制備大鼠血清，放置于-80℃冰箱中保存待檢。取大鼠肝臟組織，分離各組大鼠胸主動(dòng)脈放于福爾馬林試劑中保存，待做組織切片。

1.5 標(biāo)本測(cè)定及切片制作 用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法檢測(cè)大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等指標(biāo)。檢測(cè)地點(diǎn)是皖南醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室。肝臟以及胸主動(dòng)脈HE染色制作組織切片，觀察形態(tài)學(xué)改變。切片制作地點(diǎn)皖南醫(yī)學(xué)院組胚實(shí)驗(yàn)室。

2 結(jié)果

2.1 維生素D干預(yù)后血脂及炎癥因子的變化 卵巢切除組通過免疫損傷聯(lián)合高脂飲食11周后血清指標(biāo)TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α、HDL-C、LDL-C 7項(xiàng)血液指標(biāo)均高于對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢切除組TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α、HDL-C與維生素D組無顯著差別(P>0.05)；卵巢切除組LDL-C低于維生素D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血脂及炎癥因子水平比較

2.2 大鼠肝臟HE染色切片觀察結(jié)果 圖1顯示對(duì)照組肝細(xì)胞大小正常，形態(tài)規(guī)則，排列有序，肝小葉清晰，肝細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)可見的脂肪顆粒，胞漿染色淺且均勻。圖2顯示卵巢切除組肝細(xì)胞排列較紊亂，大小較圖1欠規(guī)則，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞整體染色較圖1偏深，細(xì)胞核突出，肝小葉模糊，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見明顯的脂肪空泡。圖3顯示維生素D組肝細(xì)胞排列紊亂，大小形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞染色最深，細(xì)胞核明顯，肝小葉異常，肝細(xì)胞中存在大量明顯可見的脂肪空泡。

圖1 對(duì)照組肝臟切片圖(400×)

圖2 卵巢切除組肝臟切片圖(400×)

圖3 維生素D組肝臟切片圖(400×)

2.3 大鼠胸主動(dòng)脈HE染色切片觀察結(jié)果 圖4顯示對(duì)照組平滑肌纖維排列正常，內(nèi)皮較完整，內(nèi)膜沒有出現(xiàn)明顯增厚，內(nèi)腔無向內(nèi)凸起的纖維斑塊。圖5顯示卵巢切除組平滑肌排列正常，但內(nèi)皮不完整，內(nèi)膜有明顯增厚，腔內(nèi)形成凸起纖維斑塊。圖6顯示維生素D組平滑肌排列正常，內(nèi)皮不完整，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)腔有明顯向內(nèi)凸起纖維斑塊，有肉眼可見明顯的纖維帽形成。

圖4 對(duì)照組胸主動(dòng)脈切片圖(400×)

圖5 卵巢切除組胸主動(dòng)脈切片圖(400×)

圖6 維生素D組胸主動(dòng)脈切片圖(400×)

3 討論

25(OH)D是維生素D在肝臟中通過羥基化作用轉(zhuǎn)化而來，由于其半衰期較長(zhǎng)是人體中維生素D最主要的儲(chǔ)存形式，也是監(jiān)測(cè)人體中維生素D水平最良好的一個(gè)反映指標(biāo)。 目前評(píng)價(jià)人體中維生素D缺乏與否的指標(biāo)尚未取得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為：25(OH)D<15ng/ml(35nmol/L)為缺乏，15～29ng/ml(35～68nmol/L)為不足，>30ng/ml(70nmol/L)為充足。研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化形成的病理過程中免疫炎癥反應(yīng)是病變形成的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在一項(xiàng)大規(guī)模的隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)CRP、IL-6等炎性因子與25(OH)D水平呈負(fù)相關(guān)。因?yàn)樯罘绞降母淖儯藗儜敉饣顒?dòng)時(shí)間的減少，維生素D缺乏已經(jīng)成為一個(gè)普遍存在和備受關(guān)注的公共健康問題，并且研究發(fā)現(xiàn)女性缺乏狀況較男性更加嚴(yán)重。體內(nèi)的雌激素通過增加脂蛋白脂酶的活性，分解血漿TG；調(diào)節(jié)線粒體功能，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)起保護(hù)作用；調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子，增加瘦素敏感性，降低脂聯(lián)素，調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂水平，對(duì)心血管系統(tǒng)有直接的保護(hù)性作用；女性在進(jìn)入絕經(jīng)期后由于卵巢功能進(jìn)行性衰退、雌激素水平下降等原因心血管疾病以及血脂代謝異常的發(fā)病率會(huì)增加。而越來越多的研究表明維生素D與血脂代謝之間存在密切聯(lián)系，但結(jié)果尚存在爭(zhēng)議。

近年來關(guān)于維生素D是否具有保護(hù)心血管疾病的作用有諸多研究，但是結(jié)果尚存在爭(zhēng)議。根據(jù)美國(guó)一項(xiàng)循證醫(yī)學(xué)研究，全國(guó)共25 871名參與者，隨機(jī)分為安慰劑組和實(shí)驗(yàn)組，中位隨訪5.3年，研究結(jié)果補(bǔ)充維生素D與主要的降低心血管事件如心肌梗死、卒中等主要死亡終點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)[9]。根據(jù)英國(guó)學(xué)者一項(xiàng)研究成年人補(bǔ)充鈣劑和/或維生素不增加患心肌梗死、缺血性心臟病或心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[10]。根據(jù)2017年4月《美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志心臟病學(xué)》研究發(fā)現(xiàn)每月1次高劑量每日高劑量補(bǔ)充維生素D對(duì)心臟疾病并無預(yù)防作用，先前也有研究顯示低劑量補(bǔ)充維生素D對(duì)心臟疾病同樣并無預(yù)防作用[11]。但國(guó)內(nèi)外也有研究表明，適量補(bǔ)充維生素D有可能可以阻止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[12]，而維生素D缺乏在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)[13]。維生素D信號(hào)通路尚在研究當(dāng)中，可能可以解釋這兩種結(jié)果的差異。

研究顯示維生素D3可通過一系列生理機(jī)制促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣和磷的吸收，大劑量的維生素D3可使鈣離子在動(dòng)脈內(nèi)膜下沉積使動(dòng)脈發(fā)生鈣化。所以許多研究以大劑量的一次性或分次補(bǔ)充維生素D或者維生素D3，作為誘導(dǎo)劑建立動(dòng)物動(dòng)脈硬化模型的一種標(biāo)準(zhǔn)有效的實(shí)驗(yàn)方法。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，卵巢切除組TC、TG、LDL-C、HDL-C等較對(duì)照組大鼠血液指標(biāo)有顯著差異，卵巢切除組大鼠血脂水平升高。卵巢切除組大鼠內(nèi)膜出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈硬化斑塊，且炎癥反應(yīng)指標(biāo)CRP、IL-6、TNF-α較對(duì)照組明顯升高，提示卵巢切除組出現(xiàn)明顯免疫炎癥修復(fù)反應(yīng)。有研究表明，代謝損傷與PCSK9表達(dá)有關(guān)，PCSK9與LDLR結(jié)合促進(jìn)其降解導(dǎo)致代謝損傷。卵巢切除后的大鼠PCSK9的表達(dá)下降，引起LDLR表達(dá)升高，導(dǎo)致血漿LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α水平升高[14]。對(duì)照組肝臟、胸主動(dòng)脈切片觀察結(jié)構(gòu)正常，卵巢切除組肝臟組織出現(xiàn)脂肪肝，胸主動(dòng)脈觀察到明顯的動(dòng)脈硬化樣內(nèi)膜改變，和血液檢測(cè)結(jié)果相符合，動(dòng)脈硬化模型建立成功。維生素D組與卵巢切除組比較TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α、HDL-C均無顯著差別，但維生素D組LDL-C較卵巢切除組高，組織切片觀察肝臟出現(xiàn)更多的肝細(xì)胞脂肪空泡，且胸主動(dòng)脈也出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈硬化斑塊。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)充維生素D會(huì)引起LDL-C水平升高，加速動(dòng)脈硬化進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的CRP、IL-6、TNF-α卵巢切除組與維生素D組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，且維生素D組也出現(xiàn)血脂升高，肝細(xì)胞、胸主動(dòng)脈病變，提示大鼠長(zhǎng)期低劑量補(bǔ)充維生素D可能不是動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性因素。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：絕經(jīng)后婦女單純性補(bǔ)充維生素D可能不具有預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的作用。