鄂藥合葉子的化學成分及其抗炎和細胞毒活性研究

李英剛，王博博，楊 晶，陳麗婭，張 睿，劉娜娜，王 欣，高 陽，張海龍*

1. 豐潤生物科技股份有限公司，哈爾濱 150066；2. 西安交通大學藥學院，西安 710061

鄂藥合葉子(Filipendulapalmate)是薔薇科(Rosaceae)蚊子草屬植物，主要分布于我國東北地區和山西等地，是鄂倫春族民間使用的一種藥材[1-2]，主要用于治療風濕、痛風、燒傷和燙傷等癥。此外，俄羅斯遠東地區人們將其作為野蔬腌制后食用[3-4]。合葉子作為一種藥食兩用的植物，目前國內外對其化學成分和藥理活性的研究鮮有報道。為充分開發利用這種具有民族特色的藥食兩用植物，本課題組持續對合葉子進行化學成分和生物活性的研究。在本研究中，從合葉子醇提物的乙酸乙酯部位分離鑒定得到了11種化合物，其中8種化合物是首次從該植物中分離得到，且化合物1能顯著抑制RAW264.7細胞中NO的產生，且無明顯的細胞毒作用，推測其可能具有一定的體內抗炎活性；而化合物11對巨噬細胞具有明顯的細胞毒作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PuriMaster 5000型高效液相色譜儀、SuPerMax 3100型多功能酶標儀均購自上海科哲生化科技有限公司；Megres C18分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Cosmosil C18半制備型色譜柱(250 mm×10.0 mm，5 μm)均購自江蘇漢邦科技有限公司；AVANCE Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振儀(德國Bruker公司)。

1.2 試藥

合葉子全草于2019年7月末采集于黑龍江省通北林業局，經張海龍教授鑒定為光葉蚊子草(FilipendulapalmateMaxim.)，憑證標本保留在西安交通大學藥學院(編號HYZ20190728)。柱層析硅膠(100～200、200～300目)、薄層層析硅膠GF254均購自青島海洋化工有限公司；RP-C18(德國Merck公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等試劑均為分析純，均購自天津市大茂化學試劑廠；氘代試劑[薩恩化學技術(上海)有限公司]；DMEM高糖培養基、Griess試劑均購自美國Hyclone公司；胎牛血清、青鏈雙抗均購自美國Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、胰蛋白酶、噻唑藍[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-Z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide), MTT]等均購自美國Sigma公司。

2 方法

2.1 提取

將15.0 kg合葉子全草陰干后，使用體積分數為95%的乙醇回流提取3次。減壓回收溶劑，得浸膏929.0 g。將浸膏分散于適量蒸餾水中，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓濃縮，得石油醚萃取物155.2 g、乙酸乙酯萃取物175.6 g、正丁醇萃取物96.3 g和水層280.2 g。

2.2 化學成分分離

取乙酸乙酯層萃取物155.0 g，通過硅膠柱色譜(200～300目，900 g)分別以石油醚-乙酸乙酯(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1)、二氯甲烷-甲醇(20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶0)梯度洗脫，經薄層色譜檢識，合并相同流分，得到17個流分(EA-1～EA-17)。EA-2經硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯(100∶1)作為流動相洗脫，得到3個流分(EA-2-1～EA-2-3)，EA-2-1以石油醚作為溶劑，經過多次重結晶得到化合物1(500.2 mg)。EA-2-2經硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(200∶1)作為流動相，得3個流分(PE-2-2-1～PE-2-2-3)。EA-2-2-2經薄層色譜(preparative thin layer chromatography, PTLC)(石油醚-乙酸乙酯：20∶1)純化后得化合物2(10.0 mg)和3(4.0 mg)。EA-2-2-3經PTLC(石油醚-乙酸乙酯：20∶1)純化后得化合物4(9.2 mg)。EA-7經硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇(40∶1、20∶1、10∶1)作為流動相洗脫，得6個流分(EA-7-1～EA-7-6)。EA-7-2以甲醇-水作為溶劑，經多次重結晶得化合物5(21.8 mg)。EA-7-3經PTLC(石油醚-乙酸乙酯：5∶1)純化后得化合物6(24.0 mg)。EA-7-4經PTLC純化后得到化合物7(7.3 mg)。EA-7-6以甲醇-水(30∶70、50∶50、70∶30)作為流動相梯度洗脫，經反相硅膠(octadecyl silane, ODS)柱色譜進一步分離，得4個流分(EA-7-6-1～EA-7-6-4)。EA-7-6-2以甲醇-水(60∶40)作為流動相洗脫，經HPLC純化后得化合物8(5.4 mg)和9(2.8 mg)。EA-7-6-3經高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法純化得化合物10(2.8 mg)和11(2.1 mg)。

2.3 體外抗炎活性篩選

2.3.1細胞毒作用測定 參考文獻方法[5]，將處于對數生長期的RAW264.7細胞，以2×105個/孔的密度接種于96孔板中。待24 h細胞貼壁后，將化合物(100 μmol·L-1)添加到培養基中繼續培養24 h，每孔加入20 μL質量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，培養4 h后，吸去孔內培養液，再加入150 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，在恒溫振蕩器上充分搖勻后于490 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

2.3.2一氧化氮生成抑制作用測定 參考文獻方法[6]，將處于對數生長期的RAW264.7細胞，以2×105個/孔的密度接種于96孔板中。37 ℃下于體積分數5% CO2細胞培養箱中培養24 h。當細胞貼壁生長后，將化合物(100 μmol·L-1)添加到培養基中，每組設3個平行。1 h后，在每個孔中添加LPS(質量濃度1 μg·mL-1)，培養24 h后，收集上清液，使用Griess試劑測定上清液中NO的含量，并計算NO抑制率。

2.3.3統計學方法 實驗結果以均值±標準差表示，采用SPSS 17.0以Dunnett’s test方法對實驗數據進進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 化合物的結構鑒定

化合物1白色無定形粉末，易溶于氯仿，硫酸乙醇顯色呈紫紅色，推斷其為三萜或甾體類化合物。分別用石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和二氯甲烷-甲醇3種展開體系，將化合物與β-谷甾醇對照品進行共薄層分析，其色譜行為完全相同，鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物2白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C7H6O3。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：10.44(2-OH，s，1H)，7.92(H-4，d，1H，J= 7.9 Hz)，7.53(H-6，t，1H，J= 7.8 Hz)，7.02(H-5，d，1H，J= 8.4 Hz)，6.93(H-3，t，1H，J= 7.5 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：173.6(C-7)，162.5(C-2)，137.0(C-4)，130.9(C-6)，119.7(C-5)，118.0(C-3)，113.9(C-1)。將化合物數據與文獻數據[7]比對，確定該化合物為水楊酸。

化合物3白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C20H40O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：4.15(H-1，d，2H，J= 7.0 Hz)，3.65(H-2，d，1H，J= 6.6 Hz)，1.67(H-3，s，3H)，0.86(H-17、H-18，m，6H)，0.84(H-19、H-20，d，6H，J= 2.8 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：140.5(C-3)，123.2(C-2)，59.6(C-1)，40.1(C-4)，39.5(C-14)，37.7(C-10)，37.6(C-8)，37.3(C-12)，36.7(C-6)，33.6(C-11)，32.9(C-7)，28.2(C-15)，25.9(C-5)，25.4(C-13)，24.6(C-9)，22.9(C-16)，22.3(C-17)，19.8(C-18)，19.7(C-19)，16.2(C-20)。將化合物數據與文獻數據[8]比對，確定該化合物為植物醇。

化合物4白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C29H48O2。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：5.79(H-4，s，1H)，4.32(H-6，s，1H)，1.38(H-19，s，3H)，0.90(H-21，d，3H，J=6.5 Hz)，0.85-0.77(H-26、H-27、H-29，m，9H)，0.73(H-18，s，3H)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：200.7(C-3)，168.7(C-5)，125.4(C-4)，73.4(C-6)，56.3(C-17)，55.9(C-14)，53.8(C-9)，46.1(C-24)，42.4(C-13)，39.5(C-12)，38.7(C-7)，37.9(C-10)，37.3(C-1)，35.9(C-20)，34.2(C-2)，33.9(C-22)，29.7(C-8)，29.3(C-25)，28.1(C-16)，26.3(C-23)，23.8(C-15)，22.7(C-28)，20.8(C-11)，19.8(C-18)，19.7(C-19)，19.7(C-26)，19.1(C-21)，18.9(C-27)，12.1(C-29)。將化合物數據與文獻數據[9]比對，確定該化合物為6-羥基-豆甾-4-烯-3-酮。

化合物5白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C29H46O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：3.63(H-12，d，1H，J= 6.7 Hz)，3.48(H-3，dd，1H，J= 10.5，5.2 Hz)，1.02(H-24，s，3H)，0.98(H-26，s，3H)，0.96(H-23、H-27，t，6H，J= 3.4 Hz)，0.86(H-25，s，3H)，0.79(H-29，s，3H)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：137.4(C-13)，133.3(C-18)，129.1(C-17)，117.0(C-12)，78.5(C-3)，55.7(C-5)，47.4(C-9)，39.1(C-8)，39.0(C-1)，38.8(C-4)，38.7(C-14)，36.7(C-10)，33.9(C-7)，32.9(C-22)，32.8(C-20)，32.7(C-19)，28.6(C-16)，28.5(C-2)，28.0(C-23)，27.4(C-15)，25.7(C-21)，24.0(C-11)，20.8(C-27)，19.8(C-30)，17.2(C-26)，19.6(C-6)，16.9(C-24)，16.1(C-25)，13.3(C-29)。將化合物數據與文獻數據[10]比對，確定該化合物為3β-hydroxy-28-norurs-12，17-dien。

化合物6白色油狀物，易溶于甲醇，分子式為C6H6O3。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：9.53(H-6，s，1H)，7.38(H-3，d，1H，J= 3.6 Hz)，6.57(H-4，d，1H，J= 3.5 Hz)，4.59(H-7，s，2H)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：179.2(C-6)，163.1(C-2)，154.1(C-5)，124.8(C-3)，110.7(C-4)，57.8(C-7)。將化合物數據與文獻數據[11]比對，確定該化合物為5-羥甲基糠醛。

化合物7白色無定形粉末，易溶于甲醇，分子式為C12H20O4。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：6.96-6.90(H-3，m，1H)，5.78(H-2，d，1H，J= 15.6 Hz)，2.27(H-4，t，2H，J= 7.4 Hz)，2.21(H-11，t，2H，J= 7.1 Hz)，1.63-1.56(H-6，m，2H)，1.50-1.44(H-9，m，2H)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：174.6(C-12)，168.2(C-1)，149.5(C-3)，121.4(C-2)，33.7(C-11)，31.7(C-4)，28.9(C-7)，28.9(C-8)，28.8(C-6)，28.6(C-9)，27.8(C-5)，24.7(C-10)。將化合物數據與文獻數據[12]比對，確定該化合物為(2E)-dodecenedioic acid。

化合物8白色針晶，易溶于甲醇，分子式為C9H10O5。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.06(H-2、H-6，s，2H)，4.25(H-8，q，2H，J= 7.1 Hz)，1.32(H-9，t，3H，J= 7.1 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：168.5(C-7)，146.4(C-3)，146.3(C-5)，139.5(C-4)，121.7(C-1)，110.6(C-2)，110.1(C-6)，61.7(C-8)，14.6(C-9)。將化合物數據與文獻數據[13]比對，確定該化合物為沒食子酸乙酯。

化合物9白色簇狀結晶，易溶于甲醇，分子式為C7H6O5。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.05(H-2，H-6，s，2H)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：170.3(C-7)，146.7(C-3)，146.3(C-5)，139.8(C-4)，122.1(C-1)，110.4(C-2)，110.2(C-6)。將化合物數據與文獻數據[14]比對，確定該化合物為沒食子酸。

化合物10無色油狀物，分子式為C19H36O5。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：5.76-5.64(H-9、H-10，m，2H)，4.04(H-11，dd，1H，J= 11.7，6.2 Hz)，3.90(H-12，t，1H，J= 5.7 Hz)，3.64(-OCH3，s，3H)，3.47-3.34(H-8，m，1H)，2.32(H-2，t，2H，J= 7.4 Hz)，0.88(H-18，t，3H，J= 6.7 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：176.1(C-1)，136.4(C-9)，131.3(C-10)，76.2(C-11)，76.1(C-12)，72.9(C-8)，52.3(-OCH3)，38.1(C-7)，34.6(C-2)，33.2(C-13)，33.1(C-16)，30.7(C-15)，30.5(C-5)，30.3(C-4)，26.4(C-14)，26.2(C-6)，25.9(C-3)，23.8(C-17)，14.2(C-18)。將化合物數據與文獻數據[15]比對，確定該化合物為tianshic acid methyl este。

化合物11白色無定形粉末，易溶于氯仿-甲醇混合溶劑，分子式為C30H48O4。1H-NMR(600 MHz，Pyr-d5)δH：5.63(H-12，t，1H，J=3.3 Hz)，3.65(H-3，s，1H)，1.75(H-23，s，3H)，1.51(H-29，s，3H)，1.25(H-27，s，3H)，1.16(H-26，d，3H，J=6.6 Hz)，1.13(H-30，s，3H)，1.03(H-25，s，3H)，0.93(H-24，s，3H)。13C-NMR(150 MHz，Pyr-d5)δC：181.4(C-28)，140.5(C-13)，128.7(C-12)，77.9(C-3)，73.2(C-19)，56.2(C-5)，55.0(C-18)，48.9(C-17)，48.1(C-9)，42.9(C-20)，42.4(C-14)，41.1(C-8)，39.9(C-4)，38.8(C-22)，38.2(C-1)，37.9(C-10)，34.1(C-7)，29.9(C-15)，29.3(C-2)，29.1(C-23)，27.6(C-29)，27.4(C-21)，26.9(C-16)，25.2(C-27)，24.5(C-11)，19.5(C-6)，17.9(C-26)，17.2(C-30)，17.0(C-25)，15.8(C-24)。將化合物數據與文獻數據[16]比對，確定該化合物為坡模酸。

3.2 體外抗炎活性檢測

測定了11種化合物對RAW264.7細胞產生NO的影響，并同時進行了細胞毒測定，結果見表1和表2。由表1和表2可知，化合物1能抑制巨噬細胞中NO的產生，同時無明顯的細胞毒，推測其可能具有一定的體內抗炎活性。而化合物11能顯著抑制RAW264.7細胞中NO的產生，在濃度為100 μmol·L-1時，其抑制率達66.2%±3.9%，但這主要是由于其細胞毒引起的，因為當化合物11的濃度為100 μmol·L-1，與RAW264.7細胞共培養24 h后，細胞活力只有11.5%。因此，該三萜化合物具有顯著的細胞毒作用。

表1 化合物對RAW264.7細胞一氧化氮產生的抑制活性

表2 化合物對RAW264.7細胞的細胞毒作用

4 討論

鄂倫春族人民在長期的游獵生活中形成了具有鮮明民族特色的醫藥文化，但隨著社會的發展和生產、生活方式的改變，其民族醫藥文化正在逐漸消失，為了及時和更好地傳承和發揚其民族醫藥文化，課題組長期致力于對鄂倫春族民族藥的研究。近年來，筆者系統地研究了幾種鄂倫春族民族藥的化學成分及其藥理活性，從中發現了一些結構新穎且具有顯著藥理作用的化合物[17-23]，這為鄂倫春族民族藥的開發、利用提供了科學依據。研究從合葉子的乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分離得到了三萜、酚酸以及脂肪酸和甾體類化合物。在這些化合物中，三萜類成分具有顯著的細胞毒作用，而甾體化合物具有一定的抗炎作用，這些結果為進一步開發利用鄂藥合葉子奠定了研究基礎。