斷血流HPLC特征圖譜的建立及3種成分的含量測定

田京歌，周娟娟，倪 倩，馮有龍

江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 210019

斷血流為唇形科植物蔭風輪或風輪菜的干燥地上部分[1]，具有清熱解毒、涼血、止血、活血等多種功效，在臨床上應用廣泛[2-5]，化學成分主要有黃酮類、皂苷類、揮發油和其他成分，其中主要的活性成分是黃酮和皂苷類成分，且黃酮類成分含量較高[6-10]，從該藥材中分離得到的黃酮類化合物的結構類型主要是黃酮和二氫黃酮，包含香蜂草苷、柚皮素、異櫻花素、蒙花苷、芹菜素、金合歡素等17種[6,9,11]，而目前其藥材在《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020版一部斷血流項下無含量測定方法，現有的文獻報道中多以醉魚草皂苷Ⅳb作為指標成分[1,12-15]，比較單一。本文對斷血流中香蜂草苷、蒙花苷和異櫻花素3種成分的含量進行測定，并建立了化學成分高效液相色譜(high-perfermance liquid chromatography，HPLC)特征圖譜，以期為斷血流的鑒定、開發利用和質量標準研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；BS21S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

芹菜素(批號111901-201603，質量分數為99.2%)，醉魚草皂苷Ⅳb對照品(別名斷血流皂苷A，批號110782-200602，質量分數為99.5%)和蒙花苷(批號111528-201710，質量分數為96.6%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；香蜂草苷(批號J5690010，質量分數大于98%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；異櫻花素(批號B21567)、金合歡素(批號B20627)、柚皮素(批號B21596)，質量分數均大于98%，均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純均購自美國Fisher公司；水為去離子水(自制)；其他試劑均為分析純。斷血流均購自藥店，產地分別為廣西、湖北和安徽，經江蘇省食品藥品監督檢驗研究院中藥室胡浩彬主任鑒定為唇形科植物燈籠草[Clinopodiumpolycephalum(Vaniot) C.Y.Wu et Hsuan]和風輪菜[Clinopodiumchinense(Benth.) O.Kuntze]的干燥地上部分。見表1。

表1 樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 HPLC特征圖譜的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇(A)-水(B)。梯度洗脫條件為0～5 min，40% A；5～30 min，40%～50% A；30～35 min，50% A；35～58 min，50%～90% A；58～67 min，90% A。檢測波長為250 nm。流速為1.0 mL·min-1。柱溫為30 ℃。進樣量為10 μL。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1供試品溶液的制備 取斷血流粉末(過3號篩)，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為75%的乙醇20 mL，稱定質量，置于水浴中加熱回流30 min，放冷，稱定質量，用體積分數為75%的乙醇補足質量，揺勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2.2對照品溶液的制備 分別精密稱定香蜂草苷、柚皮素、蒙花苷、芹菜素、異櫻花素、金合歡素和醉魚草皂苷Ⅳb對照品，加體積分數為75%的乙醇制成質量濃度均約為1 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3方法學考察

2.1.3.1精密度實驗 取斷血流(S1)，按2.1.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，以9號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD(relative standard deviation)值。結果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3.00%，表明儀器的精密度良好。

2.1.3.2穩定性實驗 取斷血流(S1)，按2.1.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，以9號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3.00%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.3.3重復性實驗 取斷血流(S1)，按2.1.2.1項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，以9號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3.00%，表明該方法的重復性良好。

2.1.4特征圖譜建立及相似度評價 取斷血流(S1～S10)，分別按2.1.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下的色譜條件分別進樣分析，記錄色譜圖，將10批斷血流樣品測定數據以CDF格式依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)，以S1號樣品色譜圖為參照，采用中位數法，時間窗寬度設定為0.1 min，多點校正，經全譜匹配共確認11個共有峰，10批斷血流的特征圖譜及其共有模式(R)見圖1。將10批樣品與對照圖譜進行相似度評價，結果顯示，相似度均大于0.85，見表2。表明10批斷血流相似度良好，化學成分一致性較好。

注：1、2、3、8.未知峰；4.香峰草苷；5.柚皮素；6.蒙花苷；7.芹菜素；9.異櫻花素；10.金合歡素；11.醉魚草皂苷Ⅳb。

表2 10批斷血流相似度評價結果

2.1.5色譜峰的指認及相對峰面積計算 10批斷血流特征圖譜共檢測到11個共有峰，通過與混合對照品溶液圖譜中各峰保留時間及吸收波長進行比對，指認出其中的7種成分，分別為4號峰香蜂草苷、5號峰柚皮素、6號峰蒙花苷、7號峰芹菜素、9號峰異櫻花素、10號金合歡素、11號峰醉魚草皂苷Ⅳb。其中9號峰峰面積適中、分離完全、穩定性較好，選作參考峰，計算其他共有峰相對保留時間和相對峰面積，結果見表3。

2.2 斷血流藥材中3種成分的測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇(A)-水(B)。梯度洗脫條件為0～5 min，40% A；5～30 min，40%～50% A；30～35 min，50% A；35～58 min，50%～90% A；58～67 min，90% A。檢測波長分別為290 nm(香蜂草苷和異櫻花素)、330 nm(檢測蒙花苷)。流速為1.0 mL·min-1。柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

表3 10批斷血流特征圖譜共有峰相對保留時間和相對峰面積的統計結果

2.2.2溶液的制備

2.2.2.1供試品溶液的制備 取斷血流粉末(過3號篩)，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為75%的乙醇20 mL，稱定質量，置于水浴中加熱回流30 min，放冷，稱定質量，用體積分數為75%的乙醇補足質量，揺勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取香蜂草苷、蒙花苷、異櫻花素對照品，加體積分數為75%的乙醇制成質量濃度分別為1.510、0.984、1.515 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2.3空白溶液的制備 取體積分數為75%的乙醇溶液作為空白溶液。

2.2.3專屬性實驗 分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10 μL，用高效液相色譜儀測定，色譜圖見圖2。在該色譜條件下空白樣品對樣品峰無干擾；主峰保留時間分別約為27、32、48 min，理論板數按異櫻花素峰計算大于3 000，說明該方法的專屬性良好。

2.2.4線性實驗 精密量取混合對照品儲備液適量，分別置于10 mL量瓶中，加體積分數為75%的乙醇溶液稀釋制成香蜂草苷質量濃度分別為15.10、30.20、45.30、60.40、75.50、151.00 μg·mL-1，蒙花苷質量濃度分別為9.84、19.69、29.53、39.37、49.22、98.44 μg·mL-1，異櫻花素質量濃度分別為15.15、30.30、45.45、60.60、75.75、151.50 μg·mL-1的混合對照品溶液，按照2.2.1項下方法測定3種成分的含量。以質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線。由實驗結果可知，香蜂草苷的質量濃度在15.10～151.00 μg·mL-1范圍內，線性方程為y1=15.461 1x1+39.704 7，r=0.999 9，峰面積和質量濃度均呈良好的線性關系；蒙花苷的質量濃度在9.84～98.44 μg·mL-1范圍內，線性方程為y2=22.097 2x2+39.335 0，r=0.999 8，峰面積和質量濃度均呈良好的線性關系；異櫻花素的質量濃度在15.15～151.50 μg·mL-1范圍內，線性方程為y3=35.493 4x3+16.495 6，r=0.999 9，峰面積和質量濃度均呈良好的線性關系。

注：A1、A2.混合對照品溶液；B1、B2.供試品溶液；C1、C2.空白溶液；1.香蜂草苷；2.蒙花苷；3.異櫻花素。

2.2.5精密度實驗 取同一供試品溶液(S1)，重復檢測6次，并記錄色譜圖。計算得香蜂草苷峰面積的RSD值為0.75%，蒙花苷峰面積的RSD值為0.60%，異櫻花素峰面積的RSD值為0.71%，表明該方法的系統精密度良好。

2.2.6重復性實驗 精密量取同一批樣品6份，依照2.2.2.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下方法測定，計算得香蜂草苷的含量為4.670 mg·g-1，含量的RSD值為1.38%；蒙花苷的含量為1.802 mg·g-1，含量的RSD值為1.57%；異櫻花素的含量為2.086 mg·g-1，含量的RSD值為1.35%，表明該方法的重復性較好。

2.2.7穩定性實驗 將供試品溶液于室溫條件下放置12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h測定。結果表明，在室溫條件下放置12 h內，測得供試品香蜂草苷峰面積的相對標準偏差為1.07%，蒙花苷峰面積的相對標準偏差為1.88%，異櫻花素峰面積的相對標準偏差為1.57%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.8加樣回收率實驗 精密稱定同一批號已知香蜂草苷、蒙花苷及異櫻花素3種成分含量的斷血流9份(S1)，每份0.25 g，每3份為1組，按低、中、高分別精密加入一定量的3種成分的對照品，使對照品加入量為樣品原有量的50%、100%和150%，按照2.2.2.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下方法測定，結果見表4。結果顯示，回收率在97.20%～101.78%范圍內，RSD值均小于2.00%，表明該方法的回收率良好。

表4 加樣回收率的實驗結果 (n=9)

2.2.9耐用性實驗 分別測定了在標準色譜條件及不同柱溫(25、35 ℃)、不同流速(0.9、1.1 mL·min-1)、不同流動相比例(38∶62～42∶58)、不同品牌色譜柱(安捷倫、菲羅門、沃特世)條件下香峰草苷、蒙花苷和異櫻花素的含量。結果表明，在柱溫、色譜柱、流動相比例及流速等因素有微小變化時，香峰草苷含量的RSD值為0.74%，蒙花苷含量的RSD值為1.96%，異櫻花素含量的RSD值為0.70%，3種成分含量測定結果均基本無變化，表明該方法的耐用性良好。

2.2.10樣品含量測定 取不同產地的10批斷血流樣品，按照2.2.1項下方法測定3種成分的含量，結果見表5。

表5 各成分含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 提取方法考察

本研究考察了不同溶劑(甲醇、體積分數50%乙醇、體積分數為75%的乙醇、乙醇)、不同提取方法(超聲提取、水浴回流提取)和不同回流提取時間(30、60、90 min)對提取結果的影響[16]，結果顯示，將體積分數為75%的乙醇作為溶劑，應用水浴加熱回流提取的方法能獲得更高的提取率，具有較低的危害性，且重復性好。而采用不同的回流提取時間(30、60、90 min)對提取結果的影響不顯著，故將提取時間定為30 min。

3.2 流動相考察

考察了不同流動相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸、乙腈-1 mL·L-1磷酸)[17]對提取結果的影響。經研究發現，流動相為甲醇-水時，待測的黃酮類化合物的分離度較好，且與磷酸-水系統相比，其對色譜柱的損耗小，且簡單易配制，故選用甲醇-水作為流動相。

3.3 特征圖譜分析

建立了10批斷血流的特征圖譜，共標定了11個共有峰，通過與對照品比對共指認出7個色譜峰，10批樣品相似度在0.856～0.991范圍內，說明10批斷血流化學成分的一致性較好，所建立的特征圖譜可作為斷血流質量控制的依據。通過計算10批斷血流各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明，各共有峰的相對保留時間較穩定，說明各批次的各共有峰都能穩定出現。但各批次間共有峰的相對保留峰面積存在一定差異，即各批次間共有峰成分的含量存在一定差異，這可能與產地差異有關。

斷血流是斷血流制劑的原藥材，是《中國藥典》2020版收載的品種之一，具有清熱解毒、止血、涼血等多種藥理作用。有文獻報道斷血流乙醇提取物在止血[18]、降糖及內皮細胞保護[19-20]、抗氧化[21]、抗菌[22]、心臟保護[23]、活血[6]等方面都有較好的活性。黃酮類化合物可能也是其重要的藥理活性成分之一，對黃酮類化合物進行深入研究有利于更好地開發、利用斷血流資源。本研究建立了斷血流的HPLC特征圖譜，可以為藥材的基原鑒定提供參考，同時測定了香蜂草苷、蒙花苷和異櫻花素3種成分的含量，能夠為斷血流的質量標準研究和更好地開發、利用斷血流資源提供實驗依據。