基于網(wǎng)絡藥理學探析三化湯治療中風組方的科學內(nèi)涵

楊長花，程 芬，彭修娟，劉 峰，2*，戶憲珍，許 剛，2，李 華

1.陜西國際商貿(mào)學院，咸陽 712046；2.陜西步長制藥有限公司，西安 710075；3.陜西省核工業(yè)215醫(yī)院，咸陽 712046；4.咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，咸陽 712046

經(jīng)典名方三化湯出自《素問病機氣宜保命集·中風論第十》，為金元醫(yī)家劉完素創(chuàng)制，劉氏在其著作中述及：“若忽中臟者，則大便多秘澀，宜以三化湯通其滯。”劉氏告訴后人，三化湯用于治療中風中臟腑的急性期伴有大便不通發(fā)作的患者。三化湯由大黃、枳實、厚樸、羌活組成，主治中風外有六經(jīng)之行證，內(nèi)有便溺之阻格[1-2]。4味藥古籍記載均有治療中風的作用[3]。三化湯的方解是大黃為君，瀉實攻積，清熱瀉火；枳實為臣，破氣除痞，化痰消積；厚樸為佐，行氣、燥濕、消積；羌活為使，散寒祛風，勝濕止痛，諸藥合用，共奏通經(jīng)絡、瀉腑實的作用[4]，全方宣行氣血、通腑開結(jié)、調(diào)暢氣機、開通玄府。

用人單位及社會評價好壞是判斷課程改革及人才培養(yǎng)是否成功的根本標準，通過到用人單位調(diào)研及發(fā)放就業(yè)調(diào)查表等方式與用人單位進行了深層次的交流及探討，大部分用人單位對課改的效果表示認同，認為學生在崗位上表現(xiàn)出的專業(yè)能力及素質(zhì)水平明顯優(yōu)于以前。

網(wǎng)絡藥理學是從系統(tǒng)角度分析藥物與機體的交互作用[5]，能體現(xiàn)中醫(yī)治療疾病多途徑、多靶點的特點[6]，可以采用網(wǎng)絡藥理學來研究中藥的作用機制。中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺 V2.0(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP V2.0)是在TCMIP V1.0的基礎上升級、優(yōu)化而建成的網(wǎng)絡藥理預測平臺，是預測和揭示中藥分子作用機制的數(shù)據(jù)研究平臺，其數(shù)據(jù)主要來自中醫(yī)藥百科全書(an encyclopaedia of traditional Chinese medicine，ETCM)的中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥方劑數(shù)據(jù)庫、中藥成分數(shù)據(jù)庫、中藥靶標數(shù)據(jù)庫、疾病相關分子庫五大數(shù)據(jù)庫，可以進行中藥、方劑、疾病、靶標、功能、通路之間的網(wǎng)絡關聯(lián)預測，并可以建立可視化的網(wǎng)絡構(gòu)圖，從而揭示中醫(yī)藥治療疾病的科學內(nèi)涵。本研究擬采用該平臺，研究經(jīng)典名方三化湯治療中風的作用機制，揭示其治療中風的科學內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 三化湯組成藥味的使用規(guī)律分析

在TCMIP V2.0平臺，在功能列表菜單欄選“組方用藥規(guī)律分析”模塊，方劑組成輸入處方藥味，主治疾病輸入“stroke”，勾選分析類型，單擊提交，即可得到三化湯組成藥味在治療中風方劑中的使用情況。

1.2 三化湯靶標預測及功能分析

在功能列表菜單欄選“中藥(含方劑)靶標預測及功能分析”模塊，選擇“藥材”，輸入三化湯處方藥味大黃、厚樸、枳實、羌活，勾選成分成藥性，數(shù)據(jù)庫勾選“GO”和“Reactome Pathway”，點擊提交，命名方劑，即可得到處方的靶標預測和功能分析。再使用韋恩圖，即可得到三化湯組成藥味之間作用靶標的交互圖。

1.3 三化湯中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘

在中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘模塊，選擇“疾病-方劑”，疾病輸入“stroke”，選方劑，點擊名稱，提交，即可得到疾病-方劑相關的核心靶標和網(wǎng)絡構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三化湯組成藥味使用規(guī)律的分析

在閩西北地區(qū)洋桔梗常見的病害有葉斑病、立枯病、霜霉病和灰霉病[5]。葉斑病用80%戊唑醇水分散粒劑6000～8000倍液噴霧防治。立枯病用3%甲霜·噁霉靈水劑(甲霜靈0.5%+噁霉靈2.5%)兌水噴霧。霜霉病可用增威贏綠殺菌劑+80%代森錳鋅可濕性粉劑600～800倍液，連續(xù)噴施2～3次。灰霉病可連續(xù)噴施20%腐霉利400～500倍液，每5～7 d噴1次，連續(xù)2次。平時要加強通風，降低棚內(nèi)空氣濕度，減少類似病例發(fā)生。

近3000名學生在學校里學習、生活，守護他們的安全，讓他們健康成長，這是一位校長的天職。可能寫信給我的這個孩子剛好目睹了這一切。這是一個細心的學生，也是一個有心的學生。我放下手中的信，感到內(nèi)心非常充實，因為我看到學校的付出和培育有了成果。這成果不是學生考了高分，進了名校，也不是他們一朝聲名顯赫，獲得高官厚祿，而是孩子澄澈的心靈和樸素的語言告訴我—他們有一顆感恩的心，他們知道自己的成長有賴于許多人的相助，包括做清潔的、做飯的叔叔阿姨。這是我做校長、當老師最大的欣慰，這是培英教育的成功。

三化湯組成藥味有厚樸、大黃、枳實、羌活，研究治療中風的成方制劑，統(tǒng)計分析該4味藥在治療中風的方劑中出現(xiàn)的頻次和藥對出現(xiàn)的頻次，結(jié)果見表1。在治療中風的7個成方制劑中，羌活出現(xiàn)7次，大黃出現(xiàn)4次，厚樸出現(xiàn)2次，表明羌活、大黃、厚樸是治療中風的關鍵藥味。再進行處方藥味治療中風的藥對分析，羌活組成71對，大黃組成58對，厚樸組成48對，進一步說明羌活、大黃、厚樸是治療中風的關鍵藥味。

2.2 三化湯組成藥味化學成分及靶標的分析

參與機體炎癥反應和免疫應答的核心靶標有VHL、NR3C1、ESR1和NFKBIA。VHL基因與β-連環(huán)蛋白、缺氧誘導因子、氧化磷酸化的調(diào)控有密切的關系[15-16]。NR3C1是糖皮質(zhì)激素受體基因，糖皮質(zhì)激素是在促腎上腺素激素作用下，刺激腎上腺皮質(zhì)細胞分泌的一種類固醇激素，具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用，糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮抗炎的作用[17-18]。ESR1是雌激素受體的ER-β亞型，雌激素通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮生理作用，雌激素可降低纖溶酶原激活物抑制因子1的活性，增加纖溶活性，還可促進一氧化氮和前列腺素的合成，這兩者都有抑制血小板聚集和黏附的作用[19]。NFKBIA是炎癥反應調(diào)節(jié)通路NF-κB信號通路的NF-κB復合物抑制蛋白基因[20]。

勘探開發(fā)一體化是精細勘探有別于常規(guī)勘探思路的一個重要方面，井位部署中必須以此為原則，統(tǒng)一考慮探井和開發(fā)井的位置，為下一步開發(fā)做準備。通過反復論證，將探井、開發(fā)井和水井納入同一個井網(wǎng)系統(tǒng)。根據(jù)低滲油田的開發(fā)經(jīng)驗，參考臨區(qū)開發(fā)方案，本區(qū)井網(wǎng)方式采用五點法不規(guī)則面積注水井網(wǎng)。探井和開發(fā)準備井采用放大的五點法，即800×566m井距，兩口相鄰探井、兩口相鄰的開發(fā)準備井之間井距為800m，探井和開發(fā)準備井之間井距為566m。根據(jù)上述部署方案，試驗區(qū)內(nèi)共部署探井9口，開發(fā)準備井6口。初步預測成熟區(qū)內(nèi)下步開發(fā)總井數(shù)為50口，其中油井35口，注水井15口，利用老井7口，新鉆井43口。

參與機體能量代謝的核心靶標有MLXIPL和HIF-1。MLXIPL在肝臟、脂肪組織、胰臟和腎臟中高度表達，主要通過磷酸化和去磷酸化途徑控制葡萄糖信號通路上的核心基因來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)糖類和脂類的代謝[21]。HIF-1是一種DNA結(jié)合蛋白，由α亞基和β亞基組成，缺氧時HIF-1α的降解被抑制而與HIF-1β形成有活性的HIF-1，HIF-1與血管內(nèi)皮細胞上的GLUT-1靶基因結(jié)合，GLUT-1表達上調(diào)促進腦細胞對血液中葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運而促進糖代謝，有利于迅速提供能量，增強腦細胞對缺氧的耐受能力[22-23]。

表1 三化湯處方藥味出現(xiàn)的頻次和關聯(lián)性分析結(jié)果

圖1 三化湯各藥味的共同靶標分析圖

2.3 三化湯治療中風的疾病-方藥核心靶標網(wǎng)絡分析

影響RNA和DNA的轉(zhuǎn)錄、復制、剪切及氧化應激等的核心靶標有ASS1、NFKB2、ELN、AR、JAG1、APP、TP53、GTF2I、SMAD4、LIMK1和HSP90AA1等，這些核心靶標通過影響RNA和DNA的合成和剪切、氧化應激等保護腦神經(jīng)細胞，修復血管結(jié)構(gòu)等發(fā)揮作用。GF-β信號通路調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡，SMAD4蛋白是TGF-β誘導的基因表達調(diào)控的關鍵轉(zhuǎn)錄因子[24]。ASS1是合成精氨酸的關鍵酶，對體內(nèi)的尿素循環(huán)有調(diào)控作用，參與體內(nèi)的氨代謝[25]。ELN是組成細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，在穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用[26]。LIMK1是存在于腦、脊髓組織中的絲氨酸/蘇氨酸和絡氨酸雙重活性蛋白激酶，有維持神經(jīng)細胞發(fā)育的功能[27]。NFKB2在遺傳信息轉(zhuǎn)錄的過程中發(fā)揮重要作用，待轉(zhuǎn)錄的DNA序列與NFKB2蛋白結(jié)合，之后NFKB2蛋白再與其他關鍵蛋白結(jié)合(如RNA聚合酶等)[28-29]。AR是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，同時也是類固醇激素受體超家族中的一員。HSP90AA1是一類熱應激蛋白，廣泛存在于人體中，具有在各種壓力條件下保護蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的作用[30]。

圖2 三化湯治療中風的核心靶標網(wǎng)絡圖

2.4 三化湯治療中風的核心靶標

對三化湯治療中風的核心靶標進行統(tǒng)計，選取網(wǎng)絡節(jié)點度(Degree)、節(jié)點緊密度(Closeness)、節(jié)點介度(Betweenness)在中位卡值以上的節(jié)點，排名靠前的核心靶標，其通過多數(shù)靶點發(fā)揮抗炎，調(diào)節(jié)免疫，調(diào)節(jié)能量代謝，影響RNA、DNA的復制及氧化應激發(fā)揮作用，核心靶標見表2。

通過檢索藥理學平臺，收集到大黃化學成分88個，厚樸化學成分76個，枳實化學成分48個，羌活化學成分57個。各藥味的潛在靶標，大黃629個，厚樸280個，枳實222個，羌活329個。經(jīng)相似性分析≥0.8篩選后，候選靶標數(shù)量分別為大黃145個，厚樸150個，枳實84個，羌活206個。方中各味藥之間均存在共同靶標，結(jié)果見圖1。4味藥味兩兩之間、三味藥間、四味藥間都存在共同靶標，表明三化湯藥味可能存在協(xié)同增效的作用。

一年來，佛山市政府以及相關職能部門加強溝通、強化協(xié)作，借力河長制、橋長制，在西江可視化、協(xié)同化等方面取得了積極成果。全面啟動三水河口綜合執(zhí)法基地、高明船員警示教育基地、南海九江海船安檢基地、順德均安智慧監(jiān)管基地等“四大基地”建設，持續(xù)提升西江監(jiān)管能力。全力推進廣東首個交通管理系統(tǒng)（雷達）項目，建立風險分級嚴控、兩級預警機制，全面提升西江可視化。全面規(guī)范西江三處公共錨地運作管理，開展臨時裝卸點、三無閑置船、橋區(qū)隱患清零行動，持續(xù)改善西江通航環(huán)境。全力推進“兩體三區(qū)”、重點水道拖輪值守等應急網(wǎng)絡建設，全力提升西江應急救援和防污染能力。

表2 三化湯治療中風的核心靶標

利用TCMI2.0網(wǎng)絡調(diào)控機制挖掘功能構(gòu)建核心網(wǎng)絡靶標圖，結(jié)果見圖2。核心網(wǎng)絡靶標49個，其中疾病靶標33個，藥物靶標14個，二者共有靶標2個，分別是PTGS2、PRKAG2。PTGS2是前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2，是前列腺素合成中的重要酶，是一種誘導型催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，在中風發(fā)生時，受炎性介質(zhì)等的影響，產(chǎn)生大量的前列腺素，促進中風病理結(jié)果的繼續(xù)惡化[7-8]，當PTGS2受到抑制時，腦組織病灶可發(fā)生凝血，減輕病灶的惡化。PRKAG2是人類腺甘酸單磷活化蛋白激酸γ2亞基，是AMP激活的蛋白激酶，廣泛分布在全身各種組織細胞中，調(diào)控ATP的消耗和ATP的產(chǎn)生[9-10]，當中風發(fā)生時，腦組織處于缺血、缺氧狀態(tài)，細胞出現(xiàn)能量耗竭，PRKAG2可以調(diào)節(jié)細胞產(chǎn)生ATP的過程。由三化湯加減化裁的通腑化痰活血方可提高腦梗死急性期患者的治療效果，改善患者的日常生活能力，其作用機制與糾正高凝狀態(tài)、抑制血栓形成有關[11]；由三化湯加減化裁而來的活血方，治療腦梗死急性期療效顯著，能促進患者神經(jīng)功能的恢復，其作用機制可能與降低患者血清炎性因子有關[12]。研究三化湯對大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障的損傷后發(fā)現(xiàn)，大鼠對腦缺血再灌注后血腦屏障損傷具有一定的抑制作用[13-14]。三化湯治療中風的作用機制與抗炎、調(diào)節(jié)能量代謝、促進組織修復有密切關系。

2.5 三化湯治療中風的生物功能分析和通路分析

對核心靶標進行生物功能分析和信號通路分析，結(jié)果見表3和表4。

表3 三化湯治療中風的生物功能分析

由表3可見，三化湯治療中風的作用主要與20個生物功能有關，如NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)控、細胞對缺氧的反應、對脂多糖的響應、信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)去泛素化作用、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的負調(diào)控、細胞增殖、基因表達負調(diào)控、基因表達的正向調(diào)控、雄性性腺發(fā)育等，這些生物學功能與抗炎調(diào)節(jié)，免疫調(diào)節(jié)，能量調(diào)節(jié)，RNA和DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、剪切及氧化應激和激活等生物功能相關。NF-κB活性主要受到抑制因子κB(inhibitor ofκB，IkB)的影響，正常情況下NF-κB與IkB結(jié)合后，以無活性的形式存在于細胞液中，在一些炎癥因子、病毒、自由基等因素的作用下，IkB激酶(IkB kinas，IKK)會被激活，進而使得正常存在于細胞質(zhì)中的NF-κB轉(zhuǎn)移到細胞核中，并與相關靶基因序列中啟動子區(qū)域的κB序列結(jié)合，發(fā)揮其炎癥效應[31]。表4列出了7個主要的通路，有TRAF6參與NF-κB介導的激活通路、TAK1通過磷酸化和IKKS激活的NF-κB通路、白細胞介素-4和白細胞介素-13信號通路、類固醇激素受體的熱休克蛋白90伴侶循環(huán)通路、細胞受體泛素相關修飾途徑、核受體轉(zhuǎn)錄途徑、Ub-特異性加工蛋白酶途徑。白細胞介素-1β(interleukin，IL-1β)與細胞間黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1)在參與腦缺血再灌注后的炎癥過程中發(fā)揮重要的作用，其表達量的增加可引發(fā)和加重腦損傷，三化湯能降低腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中IL-1β和ICAM-1的表達，對腦缺血再灌注模型大鼠腦損傷起到一定的抑制作用[32]。樊凱芳等[32]還發(fā)現(xiàn)三化湯能明顯提高腦缺血再灌注老齡大鼠胃腸組織Na+-K+-ATP酶活性及Ca2+-ATP酶活性，對腦缺血再灌注老齡大鼠胃腸損傷有一定保護作用。自由基是腦缺血和再灌注損傷中重要的因子，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應，生成過氧化氫和氧，是機體清除自由基的關鍵酶，三化湯能明顯升高腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織中SOD的含量，明顯降低其丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，對腦缺血再灌注老齡大鼠腦損傷具有抑制作用[33]。綜上所述，三化湯通過上述生物過程和通路發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善中風腸道功能以及修復腦血管的生理活性。

表4 三化湯治療中風的通路分析

2.6 三化湯治療中風的方劑-中藥-成分-疾病-靶標-通路多維網(wǎng)絡分析

基于三化湯藥物靶標和中風的疾病靶標，構(gòu)建三化湯治療中風的方劑-中藥-成分-靶標-通路多維網(wǎng)絡，結(jié)果見圖3。在方劑和中藥中，預測到核心靶標18個，核心通路7條，活性成分24種。作用的核心靶點有APP、HSP90AA1、SMAD4、ASS1、ELN、GTF2I、LIMK1、TBL2、VHL、NFKB2、JAG1、NR3C1、TP53、MLXIPL、NFKB1A、ELN、MLXIPL、ESR1和AR。活性成分分別屬于酚酸類、甾醇類、酚類、木脂素類、黃酮類、鞣質(zhì)類和揮發(fā)油類等，其中包含大黃中的12種成分、枳實中的2種成分、厚樸中的8種成分和羌活中的2種成分。對活性成分進行成藥性分析，結(jié)果見表5。成藥性好的成分有7種，分別是橙皮素、丁香酸、厚樸脂素M、6′-甲氧基和厚樸酚、異厚樸酚、丁香醛和香草酸，成藥性中等的成分有4種，分別是山柰酚、表兒茶酸、兒茶素和乙酰龍腦酯。山柰酚能通過降低CK、LDH的活性和MDA的含量，升高SOD的活性，從而對缺氧損傷細胞發(fā)揮保護作用[34]，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌和增強機體免疫等多種藥理作用。原花青素是雙黃酮衍生物的天然多酚化合物，依據(jù)構(gòu)象或鍵合位置不同分為B1～B8亞型，B1亞型的活性最強，可以清除人體內(nèi)的自由基，保護細胞組織免受自由基的氧化損傷，其在抗氧化、抗炎等過程中發(fā)揮廣泛的藥理作用[35-36]。沒食子酸通過下調(diào)核因子κB信號轉(zhuǎn)導，降低白介素-33的表達，發(fā)揮抑制炎癥反應的作用[37]。橙皮素早期干預可明顯改善APP/PS1dE9小鼠的學習記憶能力和海馬神經(jīng)元的損傷情況，其機制可能與下調(diào)TLR2和NF-κB蛋白的表達水平有關[38]。丁香酚可通過降低氧化應激水平和抗NF-κB抑制大鼠腎缺血再灌注性損傷[39]。β-谷甾醇具有降血脂、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等藥理活性[40]。厚樸酚已經(jīng)被證實能夠與維甲酸受體α過氧化物酶體增殖因子活化受體γ等相互作用，從而參與對糖脂代謝的調(diào)控[41]。香草酸具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種藥理學活性[42]。綜上所述，三化湯的化學成分通過抗炎、抗氧化等過程發(fā)揮對中風的治療作用。

表5 三化湯治療中風的活性成分

2.7 三化湯治療中風中的理-法-方藥-成分-靶標-通路-活性的相關性分析

依據(jù)三化湯的組方理論，分析組方的理法方藥，采用網(wǎng)絡藥理平臺預測三化湯的成分、靶點、通路，構(gòu)建三化湯中醫(yī)癥候、方劑、成分、通路、靶點的關聯(lián)性網(wǎng)絡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三化湯以多成分、多靶點、多通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、修復血管管壁等藥效作用，結(jié)果見圖4。另外，自大黃預測出的標靶成分不是其瀉下的主要活性成分，大黃的瀉下活性成分是否以代謝產(chǎn)物或與其他成分結(jié)合的形式發(fā)揮瀉下作用有待進一步研究。

圖4 三化湯治療中風的理-法-方藥-成分-靶標-通路-活性的相關性分析

3 討論

三化湯用于中風急性期患者的治療，療效顯著，無不良反應[43-44]，但由于針對三化湯的基礎研究較薄弱，藥效物質(zhì)尚不清楚，使質(zhì)量控制方法針對性不強，產(chǎn)品質(zhì)量控制受到限制，故對三化湯的物質(zhì)基礎進行研究是開發(fā)此經(jīng)典名方的迫切需求。本研究發(fā)現(xiàn)三化湯治療中風的核心成分有24個，成藥性好的活性成分有橙皮素、丁香酸、厚樸脂素M、6′-甲氧基和厚樸酚、異厚樸酚、丁香醛和香草酸。作用的靶點有APP、HSP90AA1、SMAD4、ASS1、ELN、GTF2I、LIMK1、TBL2、VHL、NFKB2、JAG1、NR3C1、TP53和MLXIPL等。作用的通路有由TRAF6參與NF-κB介導的激活通路、TAK1通過磷酸化和IKKS激活的NF-κB通路、白細胞介素-4和白細胞介素-13信號通路、類固醇激素受體的熱休克蛋白90伴侶循環(huán)通路、細胞受體泛素相關修飾途徑、核受體轉(zhuǎn)錄途徑和Ub-特異性加工蛋白酶途徑。成分、靶點和通路顯示三化湯的藥效作用與抗炎和細胞修復有關系，尤其和抗炎的關系密切，這些成分、靶點、通路和文獻記載的治療中風的作用相吻合，表明本研究的結(jié)果可信。另外，預測出成藥性好的成分存在于厚樸和枳實中，而大黃的活性成分成藥性普遍較差，羌活中的活性成分較少，這些與2.1項下羌活和大黃在治療中風藥對出現(xiàn)概率高的使用規(guī)律分析相反，預示可能存在各種協(xié)同增效作用，對此尚待進一步研究。本研究通過分析藥理學數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)初步探討了三化湯治療中風的成分、靶標、通路、活性之間的關聯(lián)性，以期為三化湯治療中風提供理論研究依據(jù)，為產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。