吳茱萸堿對結(jié)直腸癌小鼠IL-6R/STAT3通路的影響

張 超，榮愛梅，張 磊，王 丹

鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，鄭州 450000

結(jié)直腸癌為臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。近年來，中醫(yī)學(xué)對結(jié)直腸癌的研究日益深入，發(fā)現(xiàn)從中藥中提取的有較強抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物是研發(fā)抗癌藥物的重要來源[2]。吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實，性溫熱，味苦辛，有小毒，有散寒止痛、助陽止瀉之功效，含有多種生物堿，吳茱萸堿為其主要活性物質(zhì)[3]。吳茱萸堿的抗腫瘤活性較強，可抑制多藥耐藥細胞株的活性等[4-5]。因此，本研究通過建立結(jié)直腸癌小鼠模型，考察吳茱萸堿對結(jié)直腸癌的抑瘤作用及可能機制，為探索結(jié)直腸癌的新藥物療法奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1150H型萊卡石蠟包埋機、PM2245 型萊卡手動輪轉(zhuǎn)切片機、倒置顯微鏡(德國Leica公司)；ALc系列電子天平(德國Sartorious公司)；1510 Multiscan GO 全波長酶標儀、Micro17 微型離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CS101-3型電熱鼓風干燥箱(上海申光儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥

順鉑(批號09112983，美國Sigma公司)；吳茱萸堿(質(zhì)量分數(shù)>98%，重慶賽普那斯科技有限公司)；RPMI 1640全培養(yǎng)基(上海安博廣利生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin，IL-6)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海美軒生物科技有限公司)；HE組織染色試劑盒(南昌雨露化學(xué)試劑有限公司)；濃縮型兔抗小鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體(美國Conning公司)；即用型小鼠抗人CD34單克隆抗體、酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；S-P超敏試劑盒、即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、微血管染色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；兔抗小鼠IL-6R、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)，磷酸化STAT3(p-STAT3)，G1/S-特異性周期蛋白-D1(G1/S specific cyclin D1，Cyclin D1)，survivin，β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗，均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 實驗動物

BALA/C小鼠59只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量(21±2)g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0034]。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。飼養(yǎng)條件：標準飼料、自然光照、55%濕度、室溫。

1.4 細胞株

CT-26結(jié)直腸癌細胞株(美國ATCC公司，保存于液氮中)。

2 方法

2.1 造模與分組

59只小鼠留取9只作為對照組，其余建立結(jié)直腸癌小鼠模型[6]：復(fù)蘇CT-26結(jié)直腸癌細胞株，采用含體積分數(shù)10%標準小牛血清的RPMI 1640全培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)，在細胞計數(shù)為2×106個·mL-1的密度下，取處于對數(shù)生長期的細胞，按0.2 mL劑量接種于小鼠右前肢皮下，接種后1周，檢測小鼠右前肢腋部皮下腫瘤直徑，若直徑>10 mm，表示造模成功。造模成功的小鼠共有40只，隨機分為模型組、順鉑組、吳茱萸堿組、順鉑+吳茱萸堿組，每組10只。

2.2 干預(yù)與標本取材

造模成功后次日開始干預(yù)，順鉑組用15 mg·kg-1·d-1順鉑灌胃，順鉑+吳茱萸堿組用15 mg·kg-1·d-1順鉑+15 mg·kg-1·d-1吳茱萸堿灌胃，對照組、模型組用等量生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)處理19周。末次灌胃24 h后，用脫頸法處死小鼠，在體積分數(shù)為75%的乙醇中浸泡5 min，于超凈臺上取出結(jié)腸，縱行剪開，平鋪，用磷酸鹽緩沖液沖洗腸腔，觀察腫瘤形成情況。一部分腫瘤組織以體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定，HE染色待檢；另一部分置于液氮中冷凍待檢。

2.3 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積、腫瘤抑制率測定

解剖結(jié)直腸組織，取出其中的腫瘤組織，稱質(zhì)量。用游標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，計算腫瘤體積、腫瘤抑制率。腫瘤體積=(腫瘤長徑×腫瘤短徑×腫瘤短徑)/2；腫瘤抑制率=(模型組小鼠腫瘤體積-其他組小鼠腫瘤體積)/模型組小鼠腫瘤體積×100%。

2.4 小鼠腫瘤組織中炎癥因子指標測定

取小鼠腫瘤組織標本50 mg，加入磷酸鹽緩沖液1 mL，置于液氮中研碎，于4 ℃條件下，以3 500 r·min-1離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液，按酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書步驟檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。操作方法：往預(yù)先包被的IL-6、IL-1β、TNF-α捕獲抗體包被微孔中依次加入血清標本、對照品、HRP標記的檢測抗體，溫育洗滌后，用3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-tetramethylbenzidine，TMB)顯色。用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值，計算IL-6、IL-1β、TNF-α的質(zhì)量濃度。

2.5 HE染色觀察造模小鼠腫瘤組織的病理學(xué)變化

取經(jīng)體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定的腫瘤組織進行石蠟包埋，用切片機切片，厚度5 μm。用二甲苯脫蠟，置于體積分數(shù)為80%的乙醇中1 min，取出，用自來水沖洗1 min，用蘇木素染色8 min，用質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1鹽酸酒精溶液分化10 s，用自來水沖洗回藍5 min，用伊紅染色60 s，用體積分數(shù)為95%的乙醇調(diào)色10 s，用無水乙醇脫水1 min，用二甲苯透明1 min，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察切片組織的病理學(xué)變化情況。

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織內(nèi)微血管密度

將玻片浸泡在濃硫酸中24 h，用自來水漂洗，干燥，浸入經(jīng)稀釋的多聚賴氨酸溶液5 min，烤干后浸入明膠溶液1 min，烘干制做免疫組織化學(xué)防脫片的玻片。免疫組織化學(xué)染色步驟：用載玻片撈片，烘干，取2.5項下制做的5 μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)，滴入一抗(鼠抗人CD34單克隆抗體)，4 ℃過夜，滴加二抗(酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封固，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。參考微血管染色試劑盒說明書染色，于顯微鏡下觀察。CD34染色呈陽性的細胞是血管內(nèi)皮細胞，褐染的為新生血管內(nèi)皮，腫瘤微血管被染為黃褐色。微血管密度(microvesse density，MVD)測定標準：棕黃色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇為一個血管計數(shù)，在(×100)視野內(nèi)選取3個高密度血管區(qū)，轉(zhuǎn)至(×200)視野計數(shù)每個區(qū)的血管數(shù)量，MVD為3個數(shù)值的平均值。

2.7 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中VEGF的水平

免疫組織化學(xué)檢測依照VEGF免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書進行，陽性細胞呈棕黃色。按陽性細胞比，陽性細胞<5%為陰性，計0分；5%～25%計1分，>25%～50%計2分，50%以上計3分；按著色結(jié)果，無色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。陽性細胞比、著色結(jié)果2項乘積≥2分為高表達。

2.8 Western blot檢測腫瘤組織中IL-6R/STAT3通路相關(guān)蛋白的水平

取液氮冷凍的腫瘤組織，在磷酸鹽緩沖液中洗滌，于4 ℃下用放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)緩沖液裂解30 min，12 000 r·min-1離心10 min后收集上清液。用BCA蛋白濃度定量試劑盒檢測裂解的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)裂解物經(jīng)質(zhì)量濃度120 g·L-1的SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜以50 g·L-1脫脂奶粉封閉4 h，與兔抗小鼠IL-6R、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、survivin、β-actin單克隆抗體(一抗)在4 ℃孵育過夜，再與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗孵育4 h。用電子化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測條帶，用Image J軟件進行定量分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及腫瘤抑制率

各組小鼠的腫瘤質(zhì)量、體積及腫瘤抑制率組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組小鼠的腫瘤質(zhì)量較輕、腫瘤體積較小(P<0.05)；與吳茱萸堿組比較，順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組小鼠的腫瘤質(zhì)量較輕、腫瘤體積較小、腫瘤抑制率較高(P<0.05)；與順鉑組比較，順鉑+吳茱萸堿組小鼠的腫瘤質(zhì)量較輕、腫瘤體積較小、腫瘤抑制率較高(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、體積及腫瘤抑制率的比較

3.2 小鼠腫瘤組織中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平

各組小鼠腫瘤組織中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組IL-6、IL-1β和TNF-α的水平較低(P<0.05)；與吳茱萸堿組比較，順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組IL-6、IL-1β和TNF-α的水平較低(P<0.05)；與順鉑組比較，順鉑+吳茱萸堿組IL-6、IL-1β和TNF-α的水平較低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的比較

3.3 小鼠腫瘤組織的病理學(xué)

模型組小鼠腫瘤組織中可見大片灶性壞死，細胞核增大、深染，大小不一，排列紊亂，有異形表現(xiàn)，呈典型惡性腫瘤細胞形態(tài)特征，腫瘤細胞密集；吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組小鼠的腫瘤細胞核固縮、變小，腫瘤細胞形態(tài)破壞，密度依次降低，腫瘤組織內(nèi)壞死區(qū)依次增大。結(jié)果見圖1。

3.4 小鼠腫瘤組織內(nèi)MVD

經(jīng)免疫組織化學(xué)SABC法染色后切片，鏡下觀察血管內(nèi)皮細胞被褐染，模型組可見微血管廣泛分布于組織間質(zhì)內(nèi)，部分無管腔、不規(guī)則，大小、形態(tài)各異，吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組微血管相對少見，且微血管數(shù)量依次減少。結(jié)果見表3、圖2。

3.5 小鼠腫瘤組織中VEGF的表達

VEGF在小鼠腫瘤組織中的陽性表達為棕黃色，主要表達于細胞質(zhì)。模型組VEGF蛋白陽性表達較強，吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組VEGF蛋白的表達量依次下降。結(jié)果見圖3。

圖1 各組小鼠腫瘤組織的HE染色結(jié)果(×200)

表3 各組小鼠腫瘤組織內(nèi)

3.6 小鼠腫瘤組織中IL-6R等的表達水平

各組小鼠腫瘤組織中STAT3蛋白的表達水平組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表達水平組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組的IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表達水平較低(P<0.05)；與吳茱萸堿組比較，順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組的IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表達水平較低(P<0.05)；與順鉑組比較，順鉑+吳茱萸堿組的IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表達水平較低(P<0.05)。結(jié)果見表4、圖4。

圖2 各組小鼠腫瘤組織內(nèi)MVD(×200)

表4 各組小鼠腫瘤組織中IL-6R、STAT3、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白表達水平的比較

4 討論

結(jié)直腸癌是源自大腸腺上皮的一種惡性腫瘤，可發(fā)生于各段大腸，目前尚未闡明其病因，主流觀點認為結(jié)直腸癌的發(fā)生與生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境、遺傳等因素相關(guān)[7]。結(jié)直腸癌在全球的發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌，病死率在惡性腫瘤中亦位居前列，對人類健康、生命構(gòu)成重大威脅。我國結(jié)直腸癌的發(fā)生率低于大部分發(fā)達國家，但病死率較高。

圖3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF的表達(×100)

注：A.模型組；B.吳茱萸堿組；C.順鉑組；D.順鉑+吳茱萸堿組。

如何降低患者病死率、改善預(yù)后，一向是相關(guān)學(xué)科研究人員的重點課題[8]。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤有悠久的歷史，并確有療效。近年來，對中藥及其活性成分誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的報道日趨增多，其中吳茱萸堿廣受關(guān)注。吳茱萸堿有抗炎、抑制血管生成、調(diào)節(jié)免疫等多種功效。有研究證明[9]，吳茱萸堿在人骨肉瘤等惡性腫瘤的抑制中有一定作用，但是否為廣譜抗腫瘤活性物質(zhì)，在體內(nèi)對人結(jié)直腸癌生長有無影響，尚不明確。

本研究通過建立結(jié)直腸癌小鼠模型觀察吳茱萸堿的抑瘤功效。從模型組到吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組，小鼠腫瘤質(zhì)量依次減輕、腫瘤體積依次減小；HE染色發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤細胞核固縮、變小，腫瘤細胞形態(tài)破壞，腫瘤組織內(nèi)壞死區(qū)依次增大，均提示吳茱萸堿對結(jié)直腸癌有抑瘤作用。近年來，研究人員將炎癥列為腫瘤的第7個特征后，關(guān)于腫瘤與炎癥關(guān)系的報道增加，并逐漸深入到分子水平[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，大多數(shù)出現(xiàn)細胞老化的實體瘤的誘發(fā)因素是由炎癥機制調(diào)控的，隨著腫瘤發(fā)展，炎癥干擾宿主免疫反應(yīng)，且可輔助腫瘤免疫治療。基于炎癥與腫瘤的關(guān)系，本研究挑選了最近研究熱度較高的炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α作為研究指標。IL-6是多功能細胞因子，參與免疫細胞調(diào)節(jié)、細胞增殖與分化、血細胞形成等生理過程，可通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因，促進腫瘤血管生成，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已在多種人類腫瘤研究中被證實[12-14]。TNF-α參與多種生理、免疫過程，是炎癥環(huán)境中心調(diào)節(jié)因子。IL-1β可促進炎癥細胞因子表達，增加內(nèi)皮細胞、上皮細胞的通透性。這些炎癥因子共同作用可加重腸黏膜炎癥，損壞腸黏膜屏障。MARTNEZ-REZA I等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α可促進上皮細胞類型的乳腺癌細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)干細胞，轉(zhuǎn)移性、侵襲性增強。結(jié)直腸癌細胞同屬于上皮細胞類型，IL-1β和TNF-α亦可能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮腫瘤干細胞特點。本研究結(jié)果顯示，從模型組到吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組，小鼠腫瘤組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平依次下降，提示IL-6、IL-1β和TNF-α水平的變化與結(jié)直腸癌的進展相關(guān)，吳茱萸堿可通過抑制上述炎癥因子的表達發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)[16]，結(jié)直腸癌是富血管惡性腫瘤，血管形成可為結(jié)直腸癌細胞提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)與氧，從而促進惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為，因此抗血管生成是治療惡性腫瘤的靶點之一。抗血管生成藥物可切斷惡性腫瘤細胞養(yǎng)分補給，阻斷癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的血行通道，順鉑等藥物即具備上述功效，但存在諸多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥在腫瘤治療中有多靶點、不良反應(yīng)小、價格低廉等優(yōu)勢，可彌補靶向抗腫瘤血管治療的缺陷。尹元元等[17]研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿有抗血管生成的活性。VEGF是已發(fā)現(xiàn)的主要促血管生成因子之一，該蛋白可與結(jié)直腸癌病灶組織中血管內(nèi)皮細胞表面受體特異性結(jié)合，發(fā)揮促新生血管形成的作用。在本實驗中，從模型組到吳茱萸堿組、順鉑組、順鉑+吳茱萸堿組，腫瘤組織中VEGF表達水平依次下降、微血管數(shù)量依次減少，提示吳茱萸堿、順鉑均可體外抑制血管生成相關(guān)蛋白的表達，并能影響腫瘤內(nèi)MVD，二者聯(lián)合時的抗腫瘤血管生成效果更佳。

STAT是一種參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活的重要轉(zhuǎn)錄因子，STAT3為STAT家族的重要成員，在結(jié)直腸癌發(fā)展前期，其活化(磷酸化)激活了炎癥通路，破壞腸黏膜屏障[18-19]。據(jù)報道[20]，在結(jié)直腸癌中，p-STAT3是預(yù)測腫瘤浸潤程度的重要因素之一。徐湖波等[21]推測下調(diào)p-STAT3蛋白是抑制結(jié)直腸癌細胞增殖與侵襲的機制之一。以上研究表明STAT3在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用。IL-6對細胞存活、免疫應(yīng)答、細胞凋亡以及增殖有重要作用，可與IL-6受體結(jié)合形成復(fù)合物，與細胞膜表面的gp130結(jié)合，促使STAT3磷酸化，p-STAT3結(jié)合特定的DNA序列，引起一系列促增殖蛋白(如cyclin D1)和抗凋亡蛋白(如survivin)的表達，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，模型組、吳茱萸堿組、順鉑組和順鉑+吳茱萸堿組IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白水平依次下降，提示吳茱萸堿對IL-6R/STAT3通路相關(guān)蛋白有抑制作用，這可能是其抑制結(jié)直腸癌的機制之一。

綜上所述，吳茱萸堿對結(jié)直腸癌小鼠有抑瘤作用，可能通過抑制IL-6R/SART通路實現(xiàn)。吳茱萸堿在結(jié)直腸癌治療中的應(yīng)用尚處于起步階段，未來需要大量動物實驗?zāi)酥僚R床試驗深入研究。