雷公藤甲素通過miR-320bAR軸對前列腺癌細胞的抑制作用

張俊強，萬久愷，姚浩宇，范 銳，辛士永

1.鄭州市中心醫院泌尿外科，鄭州 450007；2.河南科技大學第一附屬醫院泌尿外科，洛陽 471000

近年來，越來越多的研究證明，微小RNA(miRNAs)與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關[1-3]。miR-320b已被證明是與多種惡性腫瘤發生密切相關的miRNA，miR-320b在胰腺癌、肺癌和鼻咽癌等惡性腫瘤組織中均呈低表達狀態，能夠調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和惡性轉化等過程[4-6]。雄激素受體(androgen receptor，AR)的表達水平變化在前列腺癌的發展進程中具有重要意義。張鵬等[7]研究發現，AR在前列腺癌的增殖、凋亡及血管新生等過程中具有促進作用。雷公藤甲素(triptolide，TPL)是中藥雷公藤的化學成分，具有多靶點、多途徑抗腫瘤作用，最近的研究發現，TPL對前列腺癌具有抑制作用，但其作用機制仍需進一步探究[8]。因此，本研究以miR-320b/AR軸為切入點探究TPL對前列腺癌細胞的抑制作用及其作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；PCR儀(美國Bio-Rad公司)；轉印、垂直電泳儀、電泳儀電源及凝膠成像儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 試藥

雷公藤甲素(質量分數≥98%，批號XY-F5262B，上海信裕生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、Matrixgel基質膠(北京索萊寶科技有限公司)；miR-320b NC/mimics、pcDNA 3.1-AR過表達重組質粒及其對照質粒委托廣州銳博生物工程有限公司合成；AR 3′UTR野生型重組質粒(pmirGLO-AR-WT)及突變型重組質粒(pmirGLO-AR-MUT)委托上海吉生科技有限公司構建；轉染試劑(美國Thermo Fisher公司)；熒光素酶檢測試劑盒(美國BioVision公司)；AR、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(美國CST公司)。

1.3 細胞

Ln Cap、PC-3、DU145人前列腺癌細胞和RWPE-1人正常前列腺上皮細胞，購自中科院上海細胞庫。

2 方法

2.1 RT-PCR檢測miR-320b和AR mRNA的表達水平

常規收集處于對數生長期的細胞，提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟反轉錄為cDNA作為模板進行擴增。2-△△CT法計算miR-320b和AR mRNA的相對表達水平。引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR的引物序列

2.2 細胞增殖活力檢測

將處于對數期生長期的PC-3細胞接種于96孔板(4×103個/孔)，貼壁生長過夜后棄上清，于細胞中加入含有0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 nmol·L-1TPL的培養基，作為TPL組，每個濃度設5個復孔，同時以加入同體積不含藥培養基的細胞作為Control組，各組細胞培養24、48和72 h后加入20 μL MTT置于培養箱中孵育4 h，丟棄上清后向孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，放入搖床中使結晶充分溶解，然后于490 nm波長處測定其吸光度(A)并計算細胞增殖活力。

2.3 RT-PCR檢測TPL對miR-320b和AR表達水平的影響

將PC-3細胞分為Control組和TPL組，TPL組細胞使用48 h增殖活力約為50%的6.25 nmol·L-1TPL處理PC-3細胞，Control組細胞不進行藥物干預，培養48 h后按照2.1項下方法檢測miR-320b和AR mRNA的表達水平。

2.4 細胞轉染與分組

將PC-3細胞接種于6孔板，繼續培養細胞至細胞覆蓋培養孔70%～80%時，對細胞轉染miR-320b NC/mimics，6 h后棄去原有培養基，加入正常培養基培養48 h，檢測細胞轉染效率，進行后續實驗。

2.5 細胞侵襲能力檢測

收集處于對數生長期的PC-3細胞，經消化、離心和重懸后計數，將細胞分為Control組、TPL組、TPL+miR-320b NC組和TPL+miR-320b mimics組，除Control組采用不含藥的無血清培養基稀釋細胞外，其余各組均用6.25 nmol·L-1TPL處理細胞，加在Transwell上室(密度為2×104個/孔，體積為200 μL)，下室加500 μL完全培養基。根據預實驗結果，課題組選擇繼續培養48 h之后檢測細胞侵襲能力，與其他時間點比較，藥物處理細胞48 h時，其侵襲能力發生顯著變化。取出上室，用甲醇固定20 min，用棉簽擦掉上室殘余細胞，用質量濃度為10 g·L-1的結晶紫染液染色15 min后沖洗至無殘留染液，在高倍顯微鏡下選取4個視野計數細胞，取平均值。

2.6 細胞克隆能力檢測

按2.5項下方法對細胞進行分組、處理。細胞經處理后接種入6孔板中(1 000個/孔)，加入完全培養基2 mL，每組設3個復孔，根據細胞生長情況每3～4 d更換培養基。持續培養14 d后，用吉姆薩染液對孔中細胞進行染色，用PBS清洗至無染色液殘留后置于鏡下觀察，計數形成克隆的細胞數(細胞數大于10個)。

2.7 蛋白表達水平檢測

按照2.5項下方法對細胞進行分組和處理。收集處理后的各組細胞，常規提取蛋白并進行蛋白定量，確定上樣量后電泳分離蛋白，經轉膜、封閉后將膜放入一抗稀釋液中4 ℃孵育12 h，次日用TBST清洗后將膜轉移至二抗稀釋液中，于37 ℃恒溫箱中繼續反應2 h。反應完畢后再次洗膜，均勻滴加發光試劑后置于凝膠成像儀中曝光并采集圖片，用Image J分析目的蛋白灰度值及相對表達量。

2.8 熒光素酶實驗驗證miR-320b與AR的靶向關系

設計與miR-320b相結合的AR 3′-UTR序列及其突變序列，構建至雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO上。將細胞接種于24孔板中(5×104個/孔)，當細胞生長融合約80%時，共轉染AR-WT/MUT 3′-UTR報告質粒、miR-320b和對照miR-NC質粒，根據試劑盒說明書分別對細胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性進行檢測。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 miR-320b和AR在前列腺癌細胞中的表達水平

與人RWPE-1正常前列腺上皮細胞比較，LNCaP、PC-3和DU145前列腺癌細胞中miR-320b的表達量顯著降低，AR的表達量顯著上升(P<0.01)，結果見表2。選擇miR-320b表達水平最低而AR表達水平最高的PC-3細胞為研究對象進行后續實驗。

表2 miR-320b和AR在前列腺癌細胞中mRNA表達水平比較

3.2 TPL對PC-3細胞增殖活力的影響

MTT實驗結果顯示，不同濃度的TPL對PC-3細胞的增殖活力具有抑制作用，其作用呈時間和劑量依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05)。48 h時，經6.25 nmol·L-1TPL作用的PC-3細胞增殖活力接近50%，結果見圖1。

圖1 TPL對PC-3細胞增殖活力的影響

3.3 TPL對PC-3細胞miR-320b和AR水平的影響

使用6.25 nmol·L-1TPL處理細胞，結果顯示，與Control組比較，TPL組細胞中miR-320b的表達量上升，AR的表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表3。

表3 TPL對PC-3細胞miR-320b和AR mRNA表達水平的影響

3.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力變化

經TPL處理后，PC-3細胞的侵襲能力降低(P<0.01)；向細胞轉染miR-320b NC后，TPL+miR-320b NC組細胞侵襲數量無顯著變化(P>0.05)；向細胞轉染miR-320b mimics后，TPL+miR-320b mimics細胞的增殖能力顯著低于TPL組及TPL+miR-320b NC組(P<0.01)，結果見表4、圖2。

表4 各組細胞侵襲數量的比較

圖2 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力的結果

3.5 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆能力變化

經TPL處理后，PC-3細胞克隆形成數量減少，克隆能力降低(P<0.01)；向細胞轉染miR-320b NC后，TPL+miR-320b NC組細胞克隆數量無顯著變化(P>0.05)；向細胞轉染miR-320b mimics后，TPL+miR-320b mimics組細胞克隆數量顯著少于TPL組及TPL+miR-320b NC組(P<0.01)，結果見圖3、表5。

圖3 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆能力的結果

3.6 Western blot檢測AR及EMT轉化過程蛋白表達水平

經TPL處理后，PC-3細胞中AR、N-cadherin和vimentin的表達水平降低，E-cadherin的表達水平升高(P<0.05)；向細胞轉染miR-320b NC后，TPL+miR-320b NC組PC-3細胞中AR、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達水平無顯著變化(P>0.05)；向細胞轉染miR-320b mimics后，TPL+miR-320b mimics組細胞中AR、N-cadherin和vimentin的表達水平低于TPL組及TPL+miR-320b NC組，E-cadherin的表達水平高于TPL組及TPL+miR-320b NC組，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見圖4、表6。

表5 各組細胞克隆數量的比較

圖4 Western blot檢測AR及EMT轉化過程蛋白表達水平的結果

3.7 miR-320b對AR的靶向調控作用

為了證實miR-320b對AR基因表達具有調控作用，本研究在PC-3細胞中進行了熒光素酶實驗。結果顯示，轉染miR-320b+AR-WT組細胞中熒光素酶的活性(0.39±0.04)顯著低于轉染miR-NC+AR-WT組細胞(1.02±0.08)(P<0.01)；轉染miR-320b+AR-MUT組細胞中熒光素酶活性(1.04±0.09)與轉染miR-NC+AR-MUT組(1.12±0.09)比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表6 各組細胞蛋白表達水平比較

4 討論

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一[9-10]，約占全球新診斷出癌癥病例的25%[11-12]。盡管前列腺癌患者的早期檢查和治療方法已有很大改進，但該病仍是癌癥相關死亡的第二大主要原因，且前列腺癌的轉移率較高，約80%的晚期患者被診斷出發生了骨轉移[13]。因此，探究新的治療靶標在前列腺癌的臨床治療中具有重要意義。miR-320b是近年來被證明與惡性腫瘤相關的miRNA，在多種惡性腫瘤中呈低表達狀態[14]。本研究檢測了miR-320b在LNCaP、PC-3、DU145前列腺癌細胞和RWPE-1人正常前列腺上皮細胞中的表達水平。結果顯示，miR-320b在LNCaP、PC-3和DU145等前列腺癌細胞中均呈低表達狀態，其表達水平顯著低于正常前列腺上皮細胞，其中PC-3細胞miR-320b的表達水平最低，提示miR-320b的低表達可能與前列腺癌的發生有關。AR是前列腺癌發生的一個驅動因素，也是前列腺癌的常見治療靶標，多數前列腺癌患者AR的表達水平異常升高[15]。本研究的結果顯示，AR在LNCaP、PC-3和DU145等前列腺癌細胞中均呈高表達狀態，PC-3細胞AR的表達水平最高。本研究選擇miR-320b表達水平最低而AR表達水平最高的PC-3細胞為研究對象進行后續實驗。

TPL是中藥雷公藤的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎及調節免疫等作用，其抗腫瘤作用具有高效、廣譜的特點[16-17]。研究表明，TPL不僅對前列腺癌細胞有抑制作用，其對前列腺癌裸鼠移植瘤也具有較好的治療作用，且其制劑安全性良好，效果顯著[18-19]。本研究結果顯示，不同濃度的TPL對PC-3細胞的增殖活力具有抑制作用，其作用呈時間和劑量依賴性，連續處理48 h后，6.25 nmol·L-1TPL對PC-3細胞的抑制率接近50%。進一步研究發現，TPL可上調細胞中miR-320b的表達量，降低AR的表達量，并可抑制PC-3細胞的侵襲和克隆能力。EMT已被證明是大多數上皮性腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵過程，在EMT過程中，上皮細胞失去上皮表型，獲得較強的侵襲和遷移能力，表現為上皮細胞表面蛋白E-cadherin的表達下調和間充質表達蛋白N-cadherin和波形蛋白vimentin等的表達上調[20-21]。在本研究中，TPL可下調PC-3細胞中N-cadherin和vimentin的表達水平，上調E-cadherin的表達水平，表明TPL可抑制PC-3細胞的EMT轉化過程。

為了探究TPL對前列腺癌細胞的抑制作用是否與miR-320b和AR的表達變化有關，在TPL處理的基礎上向PC-3細胞轉染miR-320b NC/mimics，結果顯示，miR-320b mimics可顯著增強TPL對PC-3細胞侵襲和克隆能力的抑制作用，并進一步下調細胞中AR、N-cadherin和vimentin的表達水平，上調E-cadherin的表達水平。同時，雙熒光素酶靶標實驗進一步驗證了miR-320b與AR的關系，結果顯示，miR-320b只能抑制野生型AR-WT PC-3細胞中熒光素酶的活性，而對突變型AR-MUT PC-3細胞中熒光素酶的活性無影響，表明AR是miR-320b的潛在靶基因，miR-320b對AR基因的表達存在顯著的調控作用，提示TPL對前列腺癌細胞生物學活動的調控作用可能是通過miR-320b/AR軸實現的。

綜上所述，miR-320b和AR在前列腺癌細胞中分別呈低表達和高表達狀態，TPL可上調前列腺癌細胞PC-3 miR-320b的表達水平，下調AR的表達水平，并抑制細胞的增殖、侵襲及EMT轉化等惡性生物學行為，miR-320b可增強TPL的抗腫瘤作用，TPL的作用可能是通過miR-320b/AR軸實現的。