DA7R肽修飾的紅細胞膜包裹納米粒的制備與評價

林 雯，史瓊枝，李銀科，曾 媛，謝向陽 ，胡 華*

1. 黃石市愛康醫院檢驗科，黃石 435000；2.中國人民解放軍中部戰區總醫院藥劑科，武漢 430070

藥物遞送到腦部腫瘤部位，一般需要跨越血腦屏障和腦瘤屏障[1-2]。由于肽類的相對分子質量比蛋白質更小，故其更適合作為靶向修飾分子，引導載體攜帶藥物穿越體內屏障到達靶向部位[3]。A7R(ATWLPPR)是一種七肽，該肽在體外可以選擇性地抑制人內皮細胞的增殖。它是血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)和神經氈蛋白-1(neuropilin-1, NRP-1)的特異性配體，這2個受體在血管內皮細胞和一些腫瘤細胞中有較高水平的表達[4-7]。將A7R肽的序列倒轉過來，并且采用d-氨基酸合成，可得到腦靶向能力更強的DA7R肽[8]。

紅細胞膜包裹納米粒(red blood cell membrane-camouflaged polymeric nanoparticles，RBC-NP)是將紅細胞載體體內清除慢而釋藥行為可控性差與納米粒體內清除快而釋藥行為可控強的特點綜合起來的一種載體，其能充分發揮這2種載體各自的優勢[9-12]。

本研究擬將兼具跨血腦屏障與跨腦瘤屏障能力的靶向分子DA7R融合于紅細胞膜表面，賦予其體內長循環腦腫瘤靶向的特性，延長納米載體的體內循環時間，提高載體在腦血管部位的暴露概率，增強載體在腦部腫瘤部位的靶向遞藥功能，實現對腦部腫瘤的高效藥物遞送。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE52CS型旋轉蒸發器(上海亞榮有限公司)；Optima超速低溫離心機(美國Beckman公司)；脂質體擠出器(加拿大Avestin公司)；JY92-IID型細胞超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；NICOMP 380ZLS Zeta電位/粒度分析儀(美國Santa Barbara公司)；7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；UV-2550紫外可見光分光光度計(日本島津公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 試藥

替莫唑胺(質量分數99.6%，武漢康隆世紀科技發展有限公司)；DA7R肽(批號20200622，上海強耀生物科技有限公司)；DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG2000、1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein)，PECF]均購自上海艾韋特醫藥科技有限公司；PLGA(LA∶GA=50∶50，相對分子質量30，山東濟南岱罡生物工程有限公司)；1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)，均購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.3 動物

SD大鼠購自湖北省逸摯誠生物科技有限公司[SYXK(鄂)2016-088]。

2 方法與結果

2.1 DSPE-PEG2000-DA7R的制備

參照文獻合成DSPE-PEG2000-DA7R[8]。分別稱取DA7R肽(RPPLWTA-cys)與DSPE-PEG2000-Mal 適量(1∶1)溶于含有三乙胺(5 eq)的二甲基甲酰胺溶液中，在氮氣保護下室溫攪拌48 h，加入L-半胱氨酸(10 eq)反應4 h封閉未反應的馬來酰亞胺殘基。對該反應液以雙蒸水避光透析(截留相對分子質量3 500)48 h，冷凍干燥，得白色膨松狀產物，-20 ℃保存備用。

2.2 DA7R-NP的制備

2.2.1紅細胞膜的提取和純化 取雄性SD大鼠，體質量(220 ± 20) g，麻醉，固定，將采血針刺入心尖，收集血液存于含肝素的采血管中。將收集到的血液在1 500 r·min-1(4 ℃)條件下離心15 min，棄去上層的血漿、白細胞和血小板。加入等滲的磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)緩沖液，以1 500 r·min-1(4 ℃)離心15 min，棄去上清，重復操作3次[13]。將獲得的紅細胞濃縮液貯存于4 ℃冰箱中，備用。

取濃縮的紅細胞液1.0 mL置于離心管中，加入去離子水0.9 mL，搖勻，再加入10倍的PBS溶液0.1 mL，混勻。在10 000 r·min-1(4 ℃)條件下離心10 min，棄去上清液。重復上述步驟，直至上清液幾乎無色。收集離心管下層的淡紅色紅細胞膜，用去離子水定容至原全血體積，-20 ℃保存備用。

2.2.2PLGA納米粒的制備 采用分散揮發法制備納米粒。稱取PLGA約100 mg，溶于氯仿10 mL中；另取替莫唑胺5 mg，溶于二甲基亞砜1 mL中；將上述2種有機溶劑混合，緩慢滴加到去離子水20 mL中(1 000 r·min-1磁力攪拌)，室溫下繼續攪拌(200 r·min-1)4 h，揮去有機溶劑，得到帶藍色乳光的納米粒(nanoparticles, NP)溶液，置于4 ℃冰箱中備用。PECF標記的納米粒制備方法同上，只是在載體溶解時加入適量的PECF(終質量濃度15 μg·mL-1)。

取紅細胞膜50 μL和DSPE-PEG2000-DA7R 1 mg混合于PBS溶液1 mL(10 mol·L-1，pH為7.4)中，在37 ℃下孵育4 h(搖床振蕩頻率50 r·min-1)，得到DA7R修飾的紅細胞膜。

將功能化的紅細胞膜在超聲條件(150 W，3 min，冰浴)下進行破膜，通過脂質體擠出器(400 nm)20次，隨后將擠出的細胞膜與納米粒混合再通過擠出器(200 nm)，通過20次, 即得分散均勻的經靶向肽修飾的紅細胞膜包裹的納米粒(DA7R-NP)。

2.3 DA7R-NP理化性質的考察

2.3.1DA7R-NP形態 采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)對DA7R-NP的形態進行觀察[14]。取適量的樣品懸液用去離子水稀釋至合適濃度，小心滴加至帶有支持膜的專用篩網上，自然風干，滴加質量濃度為0.2 g·L-1的磷鎢酸液染色，自然干燥后用透射電鏡觀察形態。結果見圖1。

由圖1可見，制備的DA7R-NP粒徑約為100 nm，納米粒外層有膜狀物包裹，呈殼-核結構。納米粒外觀圓整，多為球形或近球形。

圖1 DA7R-NP的透射電鏡照片

2.3.2DA7R-NP的粒度分布和Zeta電位 用Zeta電位/粒度分析儀測定DA7R-NP的粒徑和Zeta電位。儀器的激光波長設定為639 nm，入射光與散射光的夾角為90°，測定溫度為23 ℃。儀器同時測定Zeta電位。結果見圖2。

圖2 DA7R-NP的粒徑分布

由圖2可見，DA7R-NP的平均粒徑分別為(102.8±11.7) nm，多聚分散系數(polymer dispersity index，PDI)為0.138±0.009，Zeta電位為(-4.96±1.13) mV。

2.3.3包封率 Agilent TC-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為冰醋酸水溶液(質量濃度5 g·L-1)-甲醇(90∶10)；柱溫為40 ℃；檢測波長為329 nm；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

替莫唑胺主峰與其他雜質分離度良好，輔料不干擾主藥的測定。用流動相溶液配制系列替莫唑胺對照品溶液(質量濃度0.1～30 μg·mL-1)，以峰面積(A)對質量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A=60.165C+1.534 8(r=0.999 9)，替莫唑胺的質量濃度在0.1～30 μg·mL-1范圍內與峰面積線性關系良好。高、中、低3個質量濃度的平均回收率為100.3%，RSD值為1.72%，日內精密度RSD值為1.41%，日間精密度RSD值為1.78%，溶液在5 d內的RSD值為1.75%，均符合方法學要求。

采用離心法分離納米膠體溶液中的游離藥物，經液相色譜儀測定藥物質量濃度后，計算納米粒的包封率。將樣品液加入離心管中，離心45 min(25 000 r·min-1，4 ℃)，收集上清液，用液相色譜儀測定其中游離藥物的質量濃度(C游)。

根據公式包封率=(C總-C游)/C總×100%計算納米粒的包封率，C總按投料量計算。計算得DA7R-NP的包封率為79.14%±2.57%。

2.4 穩定性考察

精密量取制備的樣品(DA7R-NP)50 μL加入PBS溶液1 mL(pH 7.4)中，混合，密封，備用。將該樣品放置于4～8 ℃環境中，于樣品制備的當天(第0天)和制備后的第30天取樣測定樣品的粒徑、電位、透光率(750 nm)和包封率，考察4 ℃條件下制劑的穩定性。

將PBS(pH 7.4)與FBS按照1∶9混合配制成稀釋液(模擬血漿)，取DA7R-NP樣品適量用混合稀釋液稀釋(1∶20)，放置于37 ℃條件下，分別于12、24 h測定透光率(750 nm)。

結果表明，在4～8 ℃條件下放置30 d后，DA7R-NP的粒徑(100.3±49.6) nm、PDI(0.135±0.011)、Zeta電位(-5.02±1.09) mV以及透光率與第0天基本一致(波動小于5%)，說明所得的納米粒在PBS中的穩定性良好，未發生聚集或沉淀。DA7R-NP的包封率在第30天時略有下降，為78.61%±2.44%。

DA7R-NP在模擬血漿中24 h的透光率波動小于5%，說明在該模擬環境下，24 h樣品的光學特征未發生明顯變化，膠體體系基本穩定。

2.5 體外釋藥行為考察

采用動態膜透析法進行體外釋藥行為考察[15-16]。分別精密量取含藥的DA7R-NP和NP混懸液2.0 mL置于透析袋(截留相對分子質量8 000)中，兩端夾緊后置于100 mL PBS(pH 5.0)中，置于恒溫水浴中(37 ℃，100 r·min-1)振蕩，在0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h取釋放介質200 μL，同時補加等體積空白釋放介質，按照2.3.3項下方法測定釋放介質中的藥物質量濃度，繪制藥物釋放曲線。見圖3。

由圖3可知，沒有紅細胞膜包裹的納米粒(NP)在8 h時基本已釋放完畢，后繼釋放增加量不大。紅細胞膜包裹的納米粒(R-NP，DA7R-NP)在12 h時釋放量幾乎不再增加。在紅細胞膜的阻滯作用下，紅細胞膜包裹的納米粒呈現出較好的緩釋性能。

圖3 DA7R-NP、R-NP、NP的體外釋藥曲線 (n=6)

2.6 細胞攝取實驗

2.6.1bEnd.3細胞對納米粒的攝取 將bEnd.3細胞接種于6孔細胞板內(1×105個/孔)，37 ℃培養(體積分數5%的二氧化碳)3 d后，移除孔中的培養基，分別加入適量經PECF標記的NP、R-NP和DA7R-NP納米混懸液，用培養基調整濃度為0.3 μmol·mL-1。孵育0.5、1、2、4 h后，棄去納米懸液，用PBS緩沖液(4 ℃)洗滌3次，胰酶溶液(質量濃度2.5 g·L-1)消化，以3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，將細胞用PBS溶液0.5 mL(4 ℃)重新混懸，用流式細胞儀測定bEnd.3細胞的熒光強度。結果見表1。

表1 bEnd.3細胞對不同制劑納米粒的攝取量

由表1可知，bEnd.3細胞對3種納米粒的攝取量都隨時間的延長而增加。從2 h開始，DA7R-NP的熒光強度明顯強于無紅細胞膜包裹的NP、R-NP。NP與R-NP之間的熒光強度無顯著性差異。說明紅細胞膜經DA7R修飾后，被bEnd.3細胞的攝取量較未修飾的納米粒有顯著提高。

2.6.2體外初步藥效評價 根據參考文獻建立體外血腦屏障模型[17-20]。用明膠D-Hank’s溶液(質量濃度20 g·L-1)將細胞插入器包被后，在每個插入器(孔徑0.4 μm、直徑12 mm、面積1.12 cm2)中接種1×104個鼠腦毛細血管內皮細胞，每2天更換1次培養液，培養6 d。于顯微鏡下觀察到細胞匯合后，將培養基加到細胞插入器的上池中，使上、下池液面差大于0.5 cm，此液面差可維持4 h以上，說明細胞已經形成了緊密連接；用電阻儀檢測插入器內、外兩側的電阻值為(213±9) Ω·cm2，說明體外血腦屏障模型基本建立成功。在細胞插入器的下池中接種入2×103個C6細胞，共培養24 h。移除細胞插入器上池中的培養基，分別加入空白培養基、含藥培養基、含藥NP、含藥R-NP和含藥DA7R-NP(替莫唑胺的終濃度為3 μmol·L-1)，繼續培養48 h，經磺基羅丹明B染色后，于540 nm波長下測定每孔A值，計算存活率。

不同替莫唑胺制劑在跨越血腦屏障后，對C6細胞的生長抑制效果見表2。腦膠質瘤C6細胞存活率從小到大依次為：DA7R-NP組

3 討論

紅細胞相關的載藥系統較傳統的藥物載體在延長藥物體內循環時間、提高藥物穩定性等方面具有一定的優勢[9]。本文將紅細胞膜用靶向肽修飾后，包覆于PLGA納米粒表面，可延長納米粒在體內的停留時間，給予納米粒更長的時間到達腦血管周圍，從而提高靶向效率。此外，本方法還適用于紅細胞膜包封率不高而納米粒包封率高的藥物。

表2 不同替莫唑胺制劑穿越體外血腦屏障模型對C6細胞存活率的影響

靶向材料的合成采用肽類修飾中常用的加成反應合成。其原理是利用DSPE-PEG2000-MAL中的馬來酰亞胺基團(-MAL)與DA7R(RPPLWTA-cys)肽半胱氨酸殘基帶有的巰基(-SH)之間的邁克爾加成反應而制備DSPE-PEG2000-DA7R。該反應條件溫和，產物質量分數高。實驗過程需要注意防止巰基氧化并控制反應溫度。

本文制備的紅細胞膜包覆的納米粒在粒徑、電子顯微鏡照片等方面與文獻報道一致[9-11]。DA7R-NP的穩定性實驗結果表明，經紅細胞膜包裹后的納米粒在低溫條件下30 d內基本穩定，制劑具有較好的穩定性。模擬血漿中穩定性實驗結果表明，DA7R-NP可以在模擬血漿中至少穩定存在24 h。這些結果可能是紅細胞膜自身良好的穩定性使然。體外釋藥行為考察結果也表明，在紅細胞膜的阻滯作用下，藥物從納米粒中的釋放速度減慢，緩釋作用顯著。

初步的體外血腦屏障模型結果表明，在DA7R肽的介導下載體跨越血腦屏障的能力顯著提高，這可能與DA7R肽可與血管內皮生長因子受體-2、神經氈蛋白-1特異性結合相關。下一步需要進一步在動物模型中考察DA7R-NP的藥物腦靶向遞送能力。

紅細胞膜表面抗原的組織相容性是制約該技術發展的重要因素。目前的策略有2種，一是采用個體化的血細胞分離制備藥物載體，二是去除紅細胞表面主要的抗原成分(如多糖、蛋白質等)。

本實驗制備的由DA7R肽修飾的紅細胞膜包裹的PLGA納米粒理化特性、穩定性良好，具有很好的藥物腦靶向遞送應用潛力。