SPAG6的DNA高甲基化對鼻咽癌細胞增殖的影響*

鐘雪敏，馮國飛，周曉瑩，黃光武△

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，南寧 530021；2.廣西醫科大學區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，南寧 530021；3.廣西區域性高發腫瘤早期防治研究重點實驗室，南寧 530021；4.廣西醫科大學生命科學研究院，南寧 530021）

鼻咽癌（NPC）是一種非淋巴瘤性鱗狀細胞癌，發生在鼻咽部的上皮內層[1]，是一種極具獨特的地理和種族分布模式的腫瘤[2]。在世界大部分區域，NPC 的發病率約為1/100 000，而在南亞，尤其華南地區（廣東省和廣西壯族自治區），發病率較前者高了100 倍。NPC 的致病風險因素包括Epstein-Barr病毒感染（EBV）、飲酒、吸煙以及接觸煙霧、煙霧、化學品和甲醛[3-4]。此外，表觀遺傳修飾，尤其DNA高甲基化修飾，是NPC發生的重要機制。目前已在NPC 中鑒定出多種重要的腫瘤抑制基因（TSG），它們被DNA 啟動子高甲基化下調，如CDH4、RASSF2A、RERG[5-7]。近年來，NPC 的治療得到飛速發展，然而患者預后較差。因此，尋找新的分子標志物對NPC 的診斷及提供精準的靶向藥物治療具有十分重要的意義。

精子相關抗原6（SPAG6），亦稱為CT141，首次在人類睪丸組織中被檢測到[8]，其主要功能是參與生殖細胞的成熟并維持精子活力和生育能力[9]。最新研究表明，SPAG6 涉及腫瘤發生發展，其被鑒定為一種腫瘤標志物，并參與個別實體瘤的治療。研究發現，SPAG6促進伯基特淋巴瘤與惡性骨髓細胞的生長[10-11]，而在非小細胞肺癌中SPAG6受DNA甲基化轉錄調控[12]，但其異位表達對非小細胞肺癌并無影響[13]。通過基因功能富集分析及信號通路富集分析發現，SPAG6與NPC的發生發展密切相關。但SPAG6 在NPC 中的生物學功能尚未清晰。本研究旨在探討SPAG6在NPC中的表達及其對NPC細胞生物學行為的影響，為SPAG6作為NPC診斷標志物和治療新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 甲基轉移酶抑制劑5-aza-dC 購于美國Sigma 公司。DMEM（高糖）培養基、胎牛血清及KSFM（含生長因子）購于美國Gibco 公司；青—鏈霉素及蘇木精染色液購于北京索萊寶責任有限公司；cDNA 逆轉錄試劑盒購于北京全式金公司；SYBR Green Supermix 購于德國Qiagen；SPAG6 和β-actin 引物購于奧科公司；Trizol 試劑和Lipofectamine 3000 轉染試劑購于美國Invitrogen；SPAG6 抗體（ab155653）購于自英國Abcam 公司；GAPDH 抗體（HRP-60004）購于美國Proteintech；熒光二抗購于美國Li-COR；pCMV6-entry-SPAG6 質粒（RC216144）及其空載質粒（PS100001）購于美國Origene公司；免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋公司；CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司。

1.2 生物信息分析 在GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中搜索并下載NPC 基因表達數據（GSE13597、GSE12452、GSE40290、GSE53819、GSE64634），分析SPAG6 在NPC 與NNE 中的轉錄表達水平。

為了研究NPC 中SPAG6 異常轉錄表達的一致性，對6 個微陣列數據集包括114 例NPC 和46 例NNE 組織進行Meta 分析。以“nasopharyngeal OR nasopharynx”“cancer OR carcinoma OR adenocarcinoma OR tumor OR tumor OR malignancy/malignant* OR neoplasm* OR oncology*”為英文檢索關鍵詞，在Pubmed 數據庫上進行搜索。比較NPC 和NNE樣本中SPAG6轉錄水平，納入標準：（1）基因表達數據來源于人類；（2）樣本均取自惡性組織或非癌性組織；（3）NNE 組和NPC 組均至少3 例；（4）涉及的患者均未接受治療。STATA 12 軟件用于Meta分析。

為了研究SPAG6 是否因啟動子高甲基化而轉錄失調，本研究使用EMBOSS（https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）探究SPAG6 啟動子區，并通過甲基化芯片（GSE62336）研究SPAG6啟動子區在NPC與NNE組織中的甲基化程度。

1.3 組織標本獲取及細胞培養 收集來自廣西醫科大學第一附屬醫院的34例NPC癌組織和29例正常鼻咽上皮（NNE）組織，所有樣本均經本院病理科醫師確診，所有患者均已知情同意并簽署知情同意書。其中，24例NPC及19例NNE組織用于RNA提取，其余10例NPC 及10例NNE樣本用于免疫組化染色技術。組織樣本獲取通過廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準（No.2016-KY-050）。正常鼻咽上皮細胞（NP69）及NPC細胞（HK1、HK1-EBV、HONE1、5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、CNE2-EBV、TW03）由廣西醫科大學重點實驗室提供。NP69細胞培養在含0.2%生長因子的KSFM培養基中，NPC 細胞培養于含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素的DMEM高糖培養基中。

1.4 RT-qPCR法檢測SPAG6 mRNA相對表達量 提取組織和細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，在Step One Plus（Applied Biosystems）儀器進行PCR反應[14]。引物序列如下：SPAG6 上游：5’-GACGTGGTCCCAACAATTCAA-3’，下游：5’-ACAGCTTCTGCTAGGTCATCAT-3’；β-actin上游：5’-CTTCGCGGGCGACGAT-3’，下游：5’-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3’。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸1 min，共40 個循環。采用2-ΔΔCT法計算SPAG6 mRNA相對表達量。

1.5 免疫組化染色檢測SPAG6 蛋白表達 制備組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，酒精水化，檸檬酸鹽修復液修復，冷卻至室溫，加入SPAG6 抗體（1∶100）4 ℃冰箱孵育過夜；復溫30 min，加入生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG聚合物和辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，自來水反藍后自然風干，中性樹膠封片。由兩位經驗豐富的病理科醫師對免疫組化結果進行評分，結果判定采用半定量計分法。染色強度的評分標準：不著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別為0 分、1 分、2 分、3 分；陽性細胞的百分比評分標準：陽性細胞占比0～5%、≤10%、11%～50%、51%～75%、＞75%分別評為0 分、1 分、2分、3分、4分。以上兩項評分的乘積即為免疫組化染色得分，表示SPAG6蛋白表達水平。

1.6 5-aza-dC 去甲基化處理 將4 株NPC 細胞（HONE1、5-8F、6-10B、TW03）以1×104個密度接種到6孔板中，每株細胞均分別加入含5 μmol/L 5-azadC的培養基和含DMSO培養基，置于細胞培養箱內孵育4 d，每天更換1 次新鮮培養基（含5-aza-dC 或DMSO）。

1.7 瞬時轉染 構建SPAG6 過表達細胞株，在NPC 細胞系5-8F 中通過克隆含完整的SPAG6 cDNA 編碼區的DNA 片段擴增到載體pCMV6-entry。使用Lipofectamine 3000 將pCMV6-entry-SPAG6 質粒及空載質粒（Ctrl）分別轉染至5-8F。

1.8 Western blotting法檢測SPAG6蛋白表達 提取細胞總蛋白[15]，煮沸使蛋白變性后，取20 μg蛋白上樣，進行NuPAGETM 4-12%Bis-Tris電泳30 min；將蛋白轉移至NC膜，5%BSA封閉90 min，加入一抗SPAG6（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜；TBST 洗膜3 次，加入熒光二抗（1∶10 000）室溫下避光孵育90 min；紅外熒光掃描儀成像后，用Image J 軟件對條帶灰度值進行分析。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 CCK-8法檢測細胞增殖 將5-8F細胞以1×103個/孔的密度接種到96孔板中，置于細胞培養箱中培養5 d。從第2 天開始，各孔加入CCK-8 溶液（10 μL/孔）孵育1.5 h，充分震蕩均勻后，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（OD）值。

1.10 統計學方法 采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPAG6 在NPC 中的表達 在5 個GEO 微陣列數據集（GSE13597、GSE12452、GSE40290、GSE53819、GSE64634）中，NPC癌組織中SPAG6的轉錄水平均明顯低于相應正常組織（均P＜0.05），見圖1。

圖1 SPAG6在NPC基因芯片中的表達情況

Meta分析顯示：單個數據集具有異質性（I2=76.4%，P＜0.001），NPC 組織中SPAG6 轉錄水平低于正常組織（SMD=-1.66，95%CI：-2.58～-0.73，P=0.000），見圖2A；通過漏斗圖繪制對發表偏倚進行檢驗，Begg 檢驗（P=0.707，圖2B）和Egger 檢驗（P=0.558，圖2C）結果均無明顯偏倚；敏感性分析結果（圖2D）揭示剔除任一研究結果均不改變結論，結果較為穩定。GEO數據集的詳細信息見表1。

表1 用于Meta分析的GEO數據集的詳細信息

圖2 SPAG6在NPC GEO芯片的Meta分析

2.2 NPC 細胞及組織中SPAG6 基因表達下調 與NP69 細胞比較，NPC 細胞中SPAG6 mRNA 相對表達量降低（P＜0.05），見圖3A。與NNE 組織比較，NPC 組織中SPAG6 mRNA 相對表達量降低（P＜0.05），圖3B。SPAG6 蛋白在NNE 細胞質和細胞膜中表達更為穩定，特別在細胞游離面的纖毛上表達更為明顯，而在NPC組織中表達較弱（P＜0.05），見圖3C。

圖3 SPAG6在NPC細胞及組織中的表達

2.3 DNA高甲基化導致SPAG6基因轉錄失調 在SPAG6 的啟動子區域發現了一個長度為770 bp（從轉錄起始位點-365～+404 bp）的CpG島（圖4A）。該啟動子區域包括8 個CpG 位點，與NNE 組織比較，NPC 組織中所有CpG 位點的平均甲基化率升高（P＜0.05），見圖4B。5-aza-dC去甲基化處理后，NPC細胞（HONE1、5-8F、6-10B、TW03）SPAG6 mRNA相對表達量升高（均P＜0.05），見圖5。

圖4 NPC和正常組織中SPAG6的DNA啟動子甲基化程度

圖5 去甲基化處理的NPC細胞中SPAG6 mRNA相對表達量

2.4 過表達SPAG6基因在體外抑制NPC細胞的增殖 轉染過表達質粒后5-8F 細胞中SPAG6 基因和蛋白表達量升高（P＜0.05），見圖6A、圖6B。SPAG6-5-8F組細胞生長較Ctrl-5-8F組緩慢，見圖6C。

圖6 過表達SPAG6抑制體外NPC細胞增殖

3 討論

SPAG6是一種新型癌睪丸抗原，主要調節某些細胞的增殖及分化，是CTA家族一員。癌睪丸抗原是最具前景的抗癌免疫反應激活蛋白質之一，僅在特定組織中表達，若其含量異常增多，則表明該腫瘤具有免疫原性[16]。研究表明，SPAG6 在肺癌及骨髓增生異常綜合征等腫瘤中的表達升高，揭示該基因對腫瘤形成起到關鍵作用[13,17]；SPAG6 通過激活PTEN/PI3K/AKT 通路促進伯基特淋巴瘤生長[10]；Yang 等[11]報道，在沉默SPAG6 表達后，惡性骨髓細胞的生長被顯著抑制。

在NPC 的研究進展中廣泛觀察到表觀遺傳學改變，包括DNA、RNA、蛋白質、miRNA 的差異修飾[18]，導致一系列抑癌基因表達失調。其中DNA高甲基化是目前報道最多的NPC 的發生機制[19]。有學者在非小細胞肺癌及骨髓增生異常綜合征中發現SPAG6高甲基化[12-13]。本研究發現，SPAG6 在NPC中亦呈現高甲基化狀態，利用甲基轉移酶抑制劑處理后，NPC細胞能恢復SPAG6的表達水平。提示在NPC中DNA高甲基化是SPAG6轉錄失活的重要機制之一。

本研究首先通過GEO 數據庫中的SPAG6 在NPC中的轉錄表達數據進行了分析，發現在NPC中SPAG6 mRNA相對表達量低于正常組織，RT-qPCR法分別對NPC 細胞及組織中SPAG6 轉錄水平進行驗證，結果與GEO 數據庫分析一致；免疫組化染色技術對SPAG6在NPC中的蛋白表達水平進行分析，發現其在NPC 中的表達低于正常組織。為進一步探索SPAG6在NPC中轉錄表達失調機制，本研究進行甲基化芯片分析，發現在NPC中SPAG6啟動子區甲基化程度高于正常組織；利用甲基轉移酶抑制劑5-aza-dC 處理NPC 細胞后，采用RT-qPCR 法檢測SPAG6表達情況，發現5-aza-dC能恢復NPC細胞的SPAG6 表達水平；通過CCK-8 實驗探索SPAG6 對NPC細胞增殖能力的影響，結果顯示SPAG6過表達在體外能有效抑制NPC 細胞的增殖。甲基化修飾介導的基因表達失活是可逆的，通過甲基轉移酶抑制劑恢復SPAG6表達可逆轉癌細胞的表型。因此，SPAG6可作為NPC基因治療的新靶點。

綜上，SPAG6基因上調能有效抑制NPC細胞增殖。SPAG6 有望作為抗癌藥物靶點應用于臨床治療。然而，SPAG6在NPC和其他腫瘤中的巨大治療潛力有待進一步探索。