LncRNA CASC15通過miR-153-3p/Nrf2反饋環調控胃癌細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化*

郭 沁，熱依拉· 加帕爾，伊爾潘· 庫爾班，肖 勇，徐 蓉，蘇莎莎

（1.新疆維吾爾自治區第三人民醫院消化科，烏魯木齊 830002；2.新疆維吾爾自治區人民醫院腫瘤科，烏魯木齊 830001；3.新疆醫科大學附屬中醫醫院消化內科，烏魯木齊 830000）

胃癌是第四大常見的癌癥，也是全球第二大癌癥相關死亡原因。盡管在外科手術和其他治療方式方面取得了進展，但患者的預后仍然較差[1]。因此，闡明胃癌發生的調控網絡，開發新的診斷和靶向治療的生物標志物是非常必要的。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類轉錄本長度超過200 nt 的非編碼RNA[2]，在癌癥的發展中具有重要的調控作用，可作為檢測癌癥的血液生物標志物[3-4]。有文獻已經證明LncRNA參與了胃癌進展和腫瘤發生[5]，如LncRNA-PVT1 和FOXM1 的正反饋回路促進胃癌的生長和侵襲[6]。CASC15 是一種保守的LncRNA，已被證明在不同的癌癥中發揮了重要的生物學功能。如LncRNA CASC15可通過調控miR-221/ARID1A 軸抑制卵巢癌進展[7]。LncRNA CASC15 通 過 調 控miR-4310/LGR5/Wnt/βcatenin信號通路促進結腸癌細胞增殖和轉移[8]。但是，它在胃癌中的作用仍然是未知的。本研究旨在探討LncRNA CASC15 對胃癌SGC-7901 細胞發展的影響，研究胃癌的發病機制，為患者的治療提供一個有價值的預后生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

經本院醫學倫理委員會批準，并在患者知情同意下，于2020 年10 月至2021 年4 月在手術后從本院病理科收集了45例胃癌組織和40例癌旁正常組織標本，患者未經過任何放/化療治療，其中男26例，女19 例，平均（48.56±6.79）歲，經過病理診斷確診，標本置于液氮中保存。

1.2 主要材料

胃癌SGC-7901細胞和人正常胃黏膜上皮GES-1細胞來自中國科學院上海細胞庫。基質膠來自上海吉至生化科技有限公司。CASC15 siRNA、Nrf2 siRNA等質粒由北京擎科生物公司合成。miR-153-3p 抑制劑（miR-153-3p inhibitor）、miR-153-3p 模擬物（miR-153-3p mimics）來自Genepharma公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 SGC-7901 和GES-1 細胞置于新鮮DMEM 培養基中，加入10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素，培養皿放置于培養箱中常規培養（37 ℃、5%CO2、飽和濕度），用胰酶分離后傳代培養。

1.3.2 細胞轉染 SGC-7901細胞接種于12孔培養板中12 h，用無FBS 的DMEM 培養基覆蓋細胞，按照Turbofect說明書將質粒分別轉染至SGC-7901細胞，培養皿置于培養箱中，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測轉染效率，48 h后收集細胞。

1.3.3 細胞活力測定 質粒轉染后的SGC-7901 細胞稀釋并接種于96 孔板，設置3 個復孔，放置于培養箱中48 h 后，取濃度為5 mg/mL 的MTT，每孔滴入20 μL，并于4 h后加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，酶標儀上檢測570 nm處的光密度值。

1.3.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 預測LncRNA CASC15 和miR-153-3p 的靶基因，組 建LncRNA CASC15 wt載體和Nrf2 wt載體，突變后的質粒命名為LncRNA CASC15 mut 和Nrf2 mut。用轉染試劑將LncRNA CASC15、Nrf2 野生與突變質粒分別與miR-153-3p mimics、mimics NC 共轉染至SGC-7901細胞并檢測熒光素酶活性。

1.3.5 細胞侵襲實驗 Transwell上室中加入200 μL稀釋的Matrigel 基質，靜置12 h。SGC-7901 細胞調整密度為1×105個，鋪于Transwell上室，下室中加入400 μL DMEM培養基，24 h后用PBS清洗，加入4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色浸染20 min后用顯微鏡觀察并拍照，每樣片隨機取4個視野計數遷移細胞，計算平均值。

1.3.6 RT-qPCR Trizol 方法提取細胞總RNA，將OD260/280值為1.8－2.0 的RNA 反轉為cDNA，得到的cDNA 為模板，參照說明書進行qPCR，每組重復3次，以SYBR Green染料法進行PCR反應，GAPDH和U6為內參基因，采用2-△△CT法計算基因的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blotting 實驗 提取各組細胞蛋白，BCA 蛋白檢測試劑盒測定所提取的蛋白濃度。每孔50 μg 總蛋白進行SDS-PAGE，然后轉印到PVDF膜上，用PBST封閉2 h，加入一抗（N-cadherin 1∶1 000；E-cadherin 1∶1 000），置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗3 次，二抗（1∶3 000）37 ℃孵育2 h，ECL 化學發光，Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像，進行灰度值分析，每組實驗重復3次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析。實驗均獨立重復3次，結果以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下調LncRNA CASC15 抑制SGC-7901 細胞的增殖、侵襲及EMT

RT-qPCR 檢測結果顯示，胃癌組織中CASC15表達高于癌旁正常組織（P＜0.01），見圖1A。SGC-7901 細胞中CASC15 表達高于GES-1 細胞（P＜0.01），見圖1B。通過siRNA技術下調了CASC15表達，結果顯示，CASC15 siRNA組細胞內CASC15表達低于siRNA NC 組（P＜0.01），見 圖1C。將CASC15 siRNA及其siRNA NC轉染細胞，進一步分析了細胞增殖、侵襲和EMT 能力，結果顯示，CASC15 siRNA 組細胞活力低于siRNA NC 組（P＜0.01），見圖1D；與siRNA NC 組比較，CASC15 siRNA組N-cadherin表達降低（P＜0.01），E-cadherin表達上升（P＜0.01），見圖1E～圖1F。CASC15 siRNA組細胞侵襲數目減少（P＜0.001），見圖1G～圖1H。表明下調LncRNA CASC15 抑制SGC-7901 細胞增殖、侵襲及EMT。

圖1 下調CASC15抑制SGC-7901細胞增殖、侵襲及EMT

2.2 LncRNA CASC15 與miR-153-3p之間的靶向關系

利用miRcode 軟件預測發現，CASC15 3’UTR和miR-153-3p 存在結合位點（圖2A）。雙熒光素酶實驗進一步驗證發現，與mimics NC+CASC15 wt組比較，CASC15 wt+miR-153-3p mimics 組熒光素酶活性降低（P＜0.01），與mimics NC+CASC15 mut組比較，CASC15 mut+miR-153-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05），見圖2B。說明CASC15與miR-153-3p之間具有靶向關系。

圖2 LncRNA CASC15與miR-153-3p的靶向關系

2.3 下調miR-153-3p 促進SGC-7901 細胞的增殖、侵襲及EMT

RT-qPCR 檢測結果顯示，胃癌組織中miR-153-3p 表達低于癌旁正常組織（P＜0.01），見圖3A；SGC-7901 細胞中miR-153-3p 表達低于GES-1 細胞（P＜0.01，），見圖3B。表明miR-153-3p在胃癌組織和細胞中低表達。下調了miR-153-3p 后發現miR-153-3p inhibitor 組細胞內miR-153-3p 表達低于inhibitor NC 組（P＜0.01），見圖3C。將miR-153-3p inhibitor 及inhibitor NC 轉染細胞，并分析了細胞增殖、侵襲和EMT 情況，發現miR-153-3p inhibitor 組細胞活力高于inhibitor NC 組（P＜0.05），見圖3D；與inhibitor NC 組比較，miR-153-3p inhibitor 組Ecadherin 表達降低（P＜0.01），N-cadherin 表達上升（P＜0.01），見圖3E～圖3F。miR-153-3p inhibitor 組細胞侵襲數目增加（P＜0.05），見圖3G～圖3H。說明下調miR-153-3p 促進SGC-7901 細胞增殖、侵襲及EMT。

圖3 下調miR-153-3p 促進SGC-7901細胞的增殖、侵襲及EMT

2.4 上 調LncRNA CASC15 通 過miR-153-3p 促 進SGC-7901細胞的增殖、侵襲及EMT

RT-qPCR 檢測結果顯示，與pcDNA-3.1（+）+mimics NC組比較，pcDNA-CASC15+mimics NC組CASC15表達升高（P＜0.01），miR-153-3p表達降低（P＜0.01），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組miR-153-3p表達升高（P＜0.01），CASC15表達降低（P＜0.01）；與pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組比較，pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics 組CASC15 表達升高（P＜0.01），miR-153-3p 表達降低（P＜0.01），見圖4A。分析上調LncRNA CASC15通過miR-153-3p 對SGC-7901 細胞增殖、侵襲及EMT的影響，結果表明，pcDNA-CASC15+mimics NC 組SGC-7901細胞活力高于pcDNA-3.1（+）+mimics NC組（P＜0.05），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics組細胞活力低于pcDNA-3.1（+）+mimics NC 組（P＜0.01），pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics 組細胞活力高于pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組（P＜0.01），見圖4B。分析Western blotting 結果可知，與pcDNA-3.1（+）+mimics NC 組比較，pcDNACASC15+mimics NC 組N-cadherin 表達上升（P＜0.01），E-cadherin 表達下降（P＜0.01），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組E-cadherin 表達上升（P＜0.01），N-cadherin 表達下降（P＜0.01）；與pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組比較，pcDNACASC15+miR-153-3p mimics 組N-cadherin表達上升（P＜0.01），E-cadherin 表達下降（P＜0.01），見圖4C～圖4D。此外，Transwell 檢測結果表明，pcDNACASC15+mimics NC 組細胞侵襲數目高于pcDNA-3.1（+）+mimics NC 組（P＜0.01），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組細胞侵襲數目低于pcDNA-3.1（+）+mimics NC 組（P＜0.01），pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics 組細胞侵襲數目高于pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 組（P＜0.01），見圖4E～圖4F。

圖4 上調LncRNA CASC15通過miR-153-3p促進SGC-7901細胞的增殖、侵襲及EMT

2.5 miR-153-3p與Nrf2的靶向關系

用TargetScan 預測發現miR-153-3p 與Nrf2 3’UTR 存在結合位點，見圖5A。后續雙熒光素酶實驗結果分析可知，與mimics NC+Nrf2 wt 組比較，Nrf2 wt+miR-153-3p mimics 組熒光素酶活性降低（P＜0.01）；與mimics NC+Nrf2 mut 組比較，Nrf2 mut+miR-153-3p mimics 組熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05），見圖5B。說明miR-153-3p 與Nrf2 具有靶向關系。

圖5 miR-153-3p與Nrf2的關系

2.6 下調Nrf2對SGC-7901細胞增殖、侵襲及EMT的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，胃癌組織中Nrf2表達高于癌旁正常組織（P＜0.01），見圖6A；SGC-7901細胞中Nrf2表達高于GES-1細胞（P＜0.01），見圖6B。結果表明，Nrf2在胃癌組織和細胞中高表達。通過siRNA技術下調了Nrf2表達，發現Nrf2 siRNA組細胞內Nrf2 表達低于siRNA NC 組（P＜0.01），見圖6C。分別將Nrf2 siRNA 及siRNA NC 對照轉染細胞，進一步分析了細胞增殖、侵襲和EMT，結果表明，Nrf2 siRNA 組細胞活力低于siRNA NC 組（P＜0.01），見圖6D；與siRNA NC組比較，Nrf2 siRNA組N-cadherin 表達降低（P＜0.01），E-cadherin 表達上升（P＜0.01），見圖6E～圖6F。細胞侵襲數目減少（P＜0.01），見圖6G～圖6H。說明下調Nrf2 能夠抑制SGC-7901細胞的增殖、侵襲及EMT。

圖6 下調Nrf2抑制SGC-7901細胞增殖、侵襲及EMT

2.7 LncRNA CASC15 通過miR-153-3p 上調Nrf2表達

分析CASC15 通過miR-153-3p 對Nrf2 表達的影響，結果顯示，CASC15 siRNA+inhibitor NC 組Nrf2 mRNA 和蛋白表達低于siRNA NC+inhibitor NC 組，siRNA NC+miR-153-3p inhibitor 組Nrf2 mRNA 及蛋白表達高于siRNA NC+inhibitor NC 組（P＜0.01）。CASC15 siRNA+miR-153-3p inhibitor組Nrf2 mRNA 及蛋白表達低于siRNA NC+miR-153-3p inhibitor組（P＜0.01），見圖7A～圖7C。表明LncRNA CASC15通過miR-153-3p上調Nrf2表達。

圖7 LncRNA CASC15通過miR-153-3p上調Nrf2表達

3 討論

越來越多的證據表明，LncRNA 在人類癌癥中發揮著越來越重要的作用[9]。在腫瘤發生過程中，LncRNA 已被報道調控轉錄或轉錄后調控過程，以及染色質重塑和亞細胞信號通路[10]。CASC15是一種新發現的LncRNA，LncRNA CASC15的高表達是胃癌預后的危險因素[11]。有文獻報道LncRNA CASC15通過調控miR4310/LGR5/Wnt/βcatenin 信號通路促進結腸癌轉移[12]。LncRNA CASC15 通過調控miR-221/ARID1A 軸抑制卵巢癌進展[7]。本研究發現，CASC15在胃癌細胞和組織中增加，體外實驗也證實了敲低CASC15 抑制胃癌細胞增殖、侵襲和EMT（P＜0.05）。由此說明，CASC15可能作為治療胃癌的一個有價值的預后生物標志物。

大量實驗證明了LncRNA 與miRNA 在胃癌中相互影響從而發揮作用。例如，LncRNA PAPAS 通過調控miRNA-188-5p 加重胃癌的進展[13]。在胃癌中，MEG3/miR-21軸通過抑制上皮－間質轉化影響細胞流動性[14]。另外還發現LncRNA SNHG16通過miR-135a 發揮致癌基因的作用[15]。為進一步研究LncRNA CASC15 在胃癌腫瘤中發生的深層次機制，通過生物信息學在線工具預測LncRNA CASC15 的下游靶點是miR-153-3p，然后通過熒光素酶報告基因檢測進行確認。很明顯，LncRNA CASC15 可以作為miR-153-3p 的海綿，且上調LncRNA CASC15 通過miR-153-3p 促進SGC-7901 細胞增殖、侵襲及EMT。另外，發現下調miR-153-3p促進SGC-7901 細胞的增殖、侵襲及EMT。以上論述表明，LncRNA CASC15 通過miR-153-3p 調控胃癌細胞發展。后續進一步研究表明，miR-153-3p靶向且調控Nrf2。越來越多的研究發現，Nrf2的異常表達在腫瘤發展過程中發揮著重要作用。例如，Nrf2 通過調節mRNA 翻譯促進胰腺癌的腫瘤維持[16]。NRAL通過miR-340-5p/Nrf2軸介導肝細胞癌順鉑耐藥性[17]。實驗結果表明，Nrf2 在胃癌組織和細胞中上調，而且siRNA下調Nrf2抑制胃癌細胞增殖、侵襲和EMT，由此說明Nrf2 在胃癌的發病機制中發揮了很重要的作用。

綜上所述，CASC15 作為一種致癌基因，通過miR-153-3p/Nrf2軸調控胃癌腫瘤發展。因此，研究CASC15 可能對治療胃癌有很大的幫助，并成為治療胃癌的一個潛在新靶點。