視神經脊髓炎譜系疾病患者外周血中CD19+CD24highCD38high調節性B細胞及相關細胞因子的變化*

廖詩為 王春陽

1 天津市環湖醫院神經康復科 300350； 2 天津醫科大學總醫院神經病學研究所

視神經炎譜系病變屬于中樞神經系統免疫炎性病變，主要臨床特征為長節段橫貫性脊髓炎、視神經炎、顱內典型特征等，常反復發作[1]。視神經炎譜系病變的特異性抗體為水通道蛋白4抗體，在病理機制中起到關鍵性作用。血腦屏障中的星形膠質細胞足突成分AQP4特異性結核水通道蛋白4抗體，可引發星形膠質細胞嚴重受損，大量丟失標志性成分纖維酸性蛋白，出現視神經炎譜系病變根本性病理損害，形成星形膠質細胞病[2]。調節性B細胞可間接反映腦組織受損程度。本研究選擇100例在天津醫科大學總醫院接受診治的視神經脊髓炎譜系病變患者，觀察其外周血腫CD19+CD24highCD38high調節性B細胞和相關細胞因子的改變，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2017年9月—2020年10月在天津醫科大學總醫院接受診治的視神經脊髓炎譜系病變患者100例作為研究組，納入標準：符合世界衛生組織制定的視神經炎譜系病變的診斷標準[3]；經臨床實驗室資料、影像學檢查、臨床特征明確診斷；均為急性期病變，EDSS評分增高>1分，持續時間超過24h無法緩解。排除標準：惡性腫瘤、急性感染性病變、血液系統病變、其他原發性眼部病變、免疫系統病變、肝腎功能異常、顱腦外傷、臨床資料缺失、精神疾患、妊娠期及哺乳期女性。其中男20例，女80例，年齡34～68歲，平均年齡(43.6±2.3)歲；同期選擇體檢健康者100例作為對照組，其中男21例，女79例，年齡34～68歲，平均年齡(43.5±2.4)歲；兩組年齡、性別等臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 采集標本：晨起抽取2ml兩管空腹靜脈血，分別置于EDTA管、檸檬酸鈉管內，EDTA管即刻送檢，用于調節B細胞監測。檸檬酸鈉管在-80℃環境下置存備用，用于監測細胞因子。PCR法監測外周血的TGF-β、IL-10的mRNA指標，嚴格根據試劑說明書完成，由北京Invitrogen公司合成Real Time PCR的基因引物，樣本總RNA提取：RNA的純度和濃度應用NanoDrop ND-2000分光光度計檢測，樣本總RNA予以Trizol法提取，cDNA逆轉錄合成：(1)去除基因組DNA反應：冰上完成反應混合液的配制， 5XgDNA Eraser Buffer 2.0μl，1μg Total RNA，1.0μl gDNA Eraser，添加RNase Free H2O，總體積為10μl，42℃進行2min孵育；(2)反轉錄反應：以上反應液加入4.0μl RNase Free H2O，4.0μl 5XPrimeScript Buffer2，1.0μl RT Primer Mix，1.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，總體積為20μl，37℃孵育15min，放入85℃ 5s，-20℃環境下置存cDNA。PCR監測樣本：RT-PCR反應體系分別配制cDNA樣品，配制體系為10μl 2XMaster Mix，0.5μl 10μmol的PCR特異引物F、R，加水至18μl總體積，5 000rpm短暫離心；在96-PCR板對應的孔內分別加入cDNA 2μl，混勻，予以PCR反應，30s 95℃，95℃ 5s PCR循環40個；40s 60℃(熒光采集)；構建PCR產物的溶解曲線，緩慢加熱至99℃。3個復孔監測樣本。流式細胞學監測CD19+CD24highCD38high調節性B細胞指標。

2 結果

2.1 兩組外周血調節B細胞及TGF-β、IL-10指標對比 與對照組相比，研究組的CD19+CD24highCD38high調節性B細胞數量及TGF-β、IL-10的mRNA指標顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血調節B細胞及TGF-β、IL-10指標對比

2.2 研究組急性期與非急性期各項指標對比 與研究組非急性期比，研究組急性期的CD19+CD24highCD38high調節性B細胞數量及外周血TGF-β、IL-10的mRNA指標顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 研究組急性期與非急性期各項指標對比

3 討論

本研究觀察視神經脊髓炎譜系病變外周血中CD19+CD24highCD38high調節性B細胞和相關細胞因子的改變及其臨床意義，結果顯示：與對照組相比，研究組的CD19+CD24highCD38high調節性B細胞數量及外周血TGF-β、IL-10的mRNA指標顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，與王煒[4]的研究結果大體一致，調節B細胞的主要特點是激活后生成抗體，活化后大量增殖且分化為記憶B細胞亞群及效應B細胞亞群(漿細胞)，漿細胞可分泌特異性抗體，對抗原進行中和執行免疫保護功能，同時可因攻擊具有免疫原性的自體組織引發的自身免疫性病變[5-6]。記憶B細胞亞群再次受到刺激后可直接分化、增殖為漿細胞，生成大量抗體，同時B細胞具有分泌各種趨化因子、細胞因子、呈遞抗原等多種抗體肺依賴性功能[7-8]；研究發現調節B細胞同時參與了腫瘤、感染性病變、自身免疫系統病變等多種病變的發病過程，可對炎性反應細胞如T細胞、DC細胞的免疫應答進行抑制，同時可誘導活化Treg細胞[9-10]；IL-10是主要的抗炎細胞因子，可經對過度炎性反應進行抑制而調控免疫反應，同時可誘導Th0發育為Th2，對Th2細胞因子進行誘導，對Th1/Th2的平衡產生影響，阻斷呈遞抗原[11-12]。本研究發現研究組抑制性細胞因子IL-10分泌下降，說明視神經脊髓炎譜系病變患者的外周血腫IL-10數量下降、功能損傷。TGF-β可負向免疫調節B細胞，同時B調節細胞可通過產生轉化生長因子而促使Treg的擴增增強。視神經脊髓炎譜系疾病外周血B調節細胞功能出現異常，數量下降，急性期增強其免疫活性，激活大量炎性因子，免疫平衡失衡，相應的抑制功能降低，引發組織受損嚴重。

綜上所述，視神經脊髓炎譜系病變急性發病期CD19+CD24highCD38high調節性B細胞的功能受損，數量顯著降低，具有重要的臨床價值。