MDM2在乳腺癌組織中表達(dá)及與MVD、VEGF相關(guān)性研究*

于秀冰 丁保鋒 劉全成

黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院 1 病理科 2 腫瘤外二科 3 麻醉科 154002

乳腺癌是發(fā)生于女性的常見惡性腫瘤，該病常見的癥狀是乳腺腫塊，其次為腋下淋巴結(jié)腫大，嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。但是有些乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)腫塊時(shí)已有遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移，失去最佳治療時(shí)間，故如何提高乳腺癌的診斷水平，改進(jìn)乳腺癌的治療方法成為新的研究熱點(diǎn)[2]。鼠雙微體基因2(MDM2)是功能及其復(fù)雜的一種蛋白，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移有影響，其過(guò)表達(dá)增加腫瘤的侵襲[3]。同時(shí)有研究報(bào)道[4]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，可通過(guò)多種途徑影響著腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；微血管密度(MVD)直接反映癌組織中新生微淋巴管和微血管的活躍程度。鑒于此，本文為分析MDM2在乳腺癌組織中表達(dá)及與MVD、VEGF相關(guān)性，選取60例乳腺癌患者進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年4月—2021年4月我院收治的60例乳腺癌患者作為研究對(duì)象。患者年齡35～56歲，平均年齡(45.15±10.05)歲；腫瘤直徑1.5～4.5cm，平均腫瘤直徑(3.03±1.02)cm；TNM分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期19例、Ⅲ期28例、Ⅳ期11例；組織學(xué)類型：黏液癌2例、導(dǎo)管內(nèi)癌4例、浸潤(rùn)性小葉癌4例、乳頭狀腺癌6例、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌44例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合行手術(shù)治療指征，且術(shù)后蘇木精—伊紅(HE)染色法確診為乳腺癌患者；(2)原發(fā)且術(shù)前未行抗腫瘤治療者；(3)知情本次研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤者；(2)合并其他嚴(yán)重疾病者；(3)術(shù)前經(jīng)放療、化療治療者；(4)意識(shí)、精神、聽覺(jué)、視力障礙者。本次研究獲得我院倫理委員會(huì)的認(rèn)證。

1.2 試劑及藥品 鼠抗人MDM2單克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體均購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色試劑盒均購(gòu)于北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 (1)樣本采集：取手術(shù)切除乳腺癌組織為觀察組，取癌旁正常組織為對(duì)照組(切取自距離腫瘤組織≥5cm處，病理檢查證實(shí)為正常肺組織)。(2)樣本制作：選取目標(biāo)部位，用福爾馬林溶液(濃度為100mmol/L)固定24h后修整組織塊，然后依次放入AF液12h、70%酒精和80%酒精各6h、95%酒精Ⅰ12h、95%酒精Ⅱ1h、100%酒精Ⅰ和100%酒精Ⅱ各1.5h，松節(jié)油Ⅰ、松節(jié)油Ⅱ、浸蠟Ⅰ各15min，浸蠟Ⅱ3.5h，包埋處理備用。(3)免疫組化(SP法)：①切片經(jīng)二甲苯脫蠟(15min×3次)， 梯度酒精(100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ各5min)，PBS沖洗5min。②30%H2O2與蒸餾水(1∶10)混合，在20℃下孵育15min，蒸餾水洗3次。③熱修復(fù)抗原：把切片放入pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液中加熱至沸騰，間隔5min后再加熱至沸騰。冷卻后PBS(pH 7.2～7.6)洗滌1～2次。④滴加適當(dāng)比例PBS稀釋的一抗。⑤滴加生物素標(biāo)記的二抗，在37℃下孵育30min，用PBS沖洗3次。⑥D(zhuǎn)AB顯色。⑦蘇木精復(fù)染1min，用蒸餾水充分洗滌，再用1%鹽酸分化2s，至水，2%氨水5s，至水。脫水(70%酒精、80%酒精、90%酒精各5min，100%Ⅰ酒精、100%Ⅱ酒精各10min)，透明(二甲苯5min×2次)，封片。(4)結(jié)果判定[5]：高倍鏡下取5個(gè)不同視野各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，MDM2陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)淡黃至棕褐色顆；MVD陽(yáng)性細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞著色棕黃色；VEGF陽(yáng)性細(xì)胞：胞質(zhì)或胞膜中呈現(xiàn)棕黃色顆粒。

2 結(jié)果

2.1 兩組MDM2、MVD、VEGF陽(yáng)性表達(dá)水平比較 觀察組的MDM2陽(yáng)性率、MVD陽(yáng)性率、VEGF陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組MDM2、MVD、VEGF陽(yáng)性表達(dá)水平比較[n(%)]

2.3 乳腺癌組織中MDM2表達(dá)量與MVD、VEGF表達(dá)量的相關(guān)性 經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中MDM2表達(dá)量與MVD、VEGF表達(dá)量呈正相關(guān)性。詳見表2。

表2 乳腺癌組織中MDM2表達(dá)量與MVD、VEGF表達(dá)量的相關(guān)性

3 討論

隨著對(duì)乳腺癌的深入研究，臨床研究發(fā)現(xiàn)[6]，乳腺癌的發(fā)生與年齡、生育情況、激素水平、社會(huì)環(huán)境因素及遺傳等密切相關(guān)，其中遺傳因素是一重要機(jī)制，抑癌基因的異常甲基化通過(guò)沉默抗增殖、抗凋亡、抗血管生成和DNA修復(fù)等基因的活性致使其正常生理功能缺失從而在腫瘤的發(fā)生中具有重要的作用。

VEGF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。一方面能夠迫害腫瘤侵襲的天然屏障，為腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。另一方面能夠提高血管通透性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增加，為毛細(xì)血管芽延伸生長(zhǎng)提供良好的基質(zhì)。并且新生血管能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，而MVD則是直接反應(yīng)新生微淋巴管和微血管的活躍程度[7]。同時(shí)MDM2參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，發(fā)揮P53非依賴的生物學(xué)活性，且與預(yù)后不良相關(guān)[8]。

MDM2、VEGF、MVD均在腫瘤的多步驟演進(jìn)中起重要作用，其潛在的理論機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步探討MDM2與VEGF、MVD之間的關(guān)系，選取60例乳腺癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組的MDM2陽(yáng)性率、MVD陽(yáng)性率、VEGF陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組。經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中MDM2表達(dá)量與MVD、VEGF表達(dá)量呈正相關(guān)性。分析原因，MDM2是一個(gè)功能極其復(fù)雜的蛋白，具有轉(zhuǎn)錄因子活性、可介導(dǎo)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)作用，也能與DNA和RNA作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而且其高表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有高度的相關(guān)性，參與癌細(xì)胞的侵襲和遷移。而腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與血液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)密切相關(guān)，而新生淋巴管道和血管無(wú)疑為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了更多途徑，VEGF可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；MVD能夠增加微淋巴管和微血管的數(shù)量，提高應(yīng)用物質(zhì)的供應(yīng)。

綜上所述，乳腺癌組織中MDM2的表達(dá)水平與MVD、VEGF表達(dá)量密切相關(guān)，可作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物。