血清miR-223、miR-148a聯合檢測用于骨肉瘤臨床診斷及預后評估價值分析

謝曉飛 高藝博 邵 哲

1 河南省鄭州市骨科醫院 450000； 2 周口市中醫院外科

骨肉瘤為惡化程度較高的骨腫瘤，早期轉移是該病的主要特點之一，約50%的患者在開始確診時已出現遠處轉移，預后較差[1]。骨肉瘤早期無明顯癥狀，出現轉移后會導致特異性癥狀出現，故而提高該疾病的早期診斷準確率極為重要。微小核糖核酸-148a(microRNA-148a，miR-148a)、微小核糖核酸-223(microRNA-223，miR-223)已被證實與多種腫瘤的發生有關，且有研究指出，骨肉瘤患者存在miR-223表達下調的現象[2]，但尚不知其與miR-148a聯合檢測對骨肉瘤的診斷價值。故本文中分析了骨肉瘤血清miR-223、miR-148a水平變化，旨在聯合檢測用于骨肉瘤臨床診斷及預后評估價值，為骨肉瘤的診治提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以2015年4月—2016年3月78例骨肉瘤患者作為研究組，并以50例健康體檢者作為對照組。研究組中男40例，女38例；年齡10～37歲，平均年齡(17.31±3.65)歲；TNM分期：T1期15例、T2期23例、T3期27例、T4期13例；分化程度：低分化14例、中分化22例、高分化42例；腫瘤部位：股骨遠端40例、脛骨近端26例、肱骨近端5例、腓骨近端7例。對照組中男27例，女23例；年齡9～35歲，平均年齡(16.97±3.72)歲。兩組性別、年齡對比無明顯差異(P>0.05)。

1.2 研究組選擇標準 (1)納入標準： ①根據《骨肉瘤診斷、治療、隨訪的ESMO臨床指南》[3]診斷為骨肉瘤，并經術中病理學確診；②患者均知情本研究的研究目的，且已簽署同意書；③符合骨肉瘤根治術指征并完成手術者；④檢查前未經放化療及手術治療者。(2)排除標準： ①自身免疫性疾病患者；②其他原發性惡性腫瘤患者；③嚴重骨質增生及骨關節炎患者；④凝血功能異常者；⑤臨床及隨訪資料不完整者；⑥中途退出研究者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：骨肉瘤患者行骨肉瘤根治術及術后化療治療。化療方案均為順鉑+異環磷酰胺+阿奇霉素治療。

1.3.2 血清miR-223、miR-148a表達水平測定：(1)血清總RNA提取：所有患者于入院后1d采集空腹肘靜脈血4ml，高速離心，提取上清液，置于-80℃環境下保存備用。將備用血清放置于4℃下解凍，然后取250μl血清+750μl Trizol室溫下靜置4～6min，再加入200μl氯仿，震蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸。在4℃下以12 000r/min轉速離心15min，將上層水相移至無RNA酶的EP管中。加入等體積異丙醇，充分混勻后靜置10～12min，以14 000r/min轉速離心 10min后，取沉淀物，用75%的乙醇洗滌沉淀物2～3次，根據沉淀量加入適量無RNA酶水溶解，置于-80℃下保存備用。應用美國Invitro-gen公司的RNA提取試劑Trizol，采用Trizol法抽取RNA。(2)PCR反應：取10μl總RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增目得條帶，同時以U6為內部對照進行擴增，引物序列見表1。PCR反應體系為20μl，反應條件為95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火31s，72℃延伸31s，45個循環，每個樣本做3個復孔，取平均值為最終結果，相對表達量：ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

表1 引物序列

1.3.3 隨訪：所有患者隨訪2～60個月，記錄患者生存時間。

1.4 觀察指標 (1)比較研究組及對照組的miR-223、miR-148a表達水平，并分析miR-223、miR-148a聯合檢測對骨肉瘤的診斷價值及與臨床病理的關系。(2)比較生存組及死亡組的miR-223、miR-148a表達水平，分析miR-223、miR-148a對骨肉瘤患者預后的評估價值及與預后的關系。

2 結果

2.1 研究組及對照組的miR-223、miR-148a表達水平比較 研究組miR-223表達水平低于對照組，miR-148a表達水平高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 研究組及對照組的miR-223、miR-148a表達水平比較

2.2 miR-223、miR-148a聯合檢測對骨肉瘤的診斷價值分析 miR-223、miR-148a表達水平檢測診斷骨肉瘤的AUC高于0.75，見表3、圖1。

表3 miR-223、miR-148a聯合檢測對骨肉瘤的診斷價值分析

圖1 miR-223、miR-148a聯合檢測診斷骨肉瘤的ROC曲線分析

2.3 miR-223、miR-148a表達水平與臨床病理的關系 根據2.2分析結果將miR-223表達水平≥2.46定義為miR-223高表達，將miR-148a≥1.07定義為miR-148a高表達。miR-223低表達組在TNM分期T3～T4期、分化程度為高分化、已出現遠處轉移方面的人數比例高于miR-223高表達組(P<0.05)，miR-148a高表達組在TNM分期T3～T4期、腫瘤直徑≥5cm、已出現遠處轉移方面的人數比例高于miR-148a低表達組(P<0.05)，見表4。

表4 miR-223、miR-148a表達水平與臨床病理的關系

2.4 生存組及死亡組的miR-223、miR-148a表達水平比較 死亡組miR-223表達水平低于生存組，miR-148a表達水平高于生存組(P<0.05)，見表5。

表5 生存組及死亡組的miR-223、miR-148a表達水平比較

2.5 miR-223、miR-148a聯合檢測對預后的評估價值分析 聯合檢測評估患者預后的AUC大于miR-223單獨檢測(P<0.05)，見表6、圖2。

圖2 miR-223、miR-148a聯合檢測評估預后的ROC曲線分析

表6 miR-223、miR-148a聯合檢測對預后的評估價值分析

2.6 miR-223、miR-148a與預后的COX回歸分析 miR-223<1.75、miR-148a≥1.0是影響患者預后的危險因素(P<0.05)，見表7。

表7 miR-223、miR-148a與預后的COX回歸分析

3 討論

miRNA分子不僅在腫瘤組織中異常表達，且在體液中也呈現異常分布現象。miR-148a位于7p18.2，其表達在多種腫瘤的發生、發展中發揮著重要調控作用，相關研究認為，miR-148a可通過下調生長阻滯和DNA損傷基因來促進癌細胞的侵襲、遷移，并能刺激β連環蛋白的細胞分布和腫瘤發生[4]。本文結果發現，研究組miR-148a表達水平高于對照組，說明骨肉瘤患者存在miR-148a表達水平升高的現象，這可能與miR-148a可靶向結合泛素蛋白酶4等，通過調控信號通路抑制癌細胞的增殖、轉移及上皮間質轉化和血管生成有關。

miR-223是一種高度保守的miRNA，僅在髓系細胞中表達。相關研究指出，通過抑制血清miR-223中表達，可促進乳腺細胞轉移[5]。蘇光建等[6]研究也指出， miR-223在多種腫瘤中的表達出現異常，可抑制癌細胞的遷移和侵襲，說明miR-223或與多種腫瘤的發生發生過程有關。本文結果顯示，研究組miR-223表達水平低于對照組，說明骨肉瘤患者血清miR-223表達水平較低。

有研究也指出，miR-148a可通過調控Bl-2抑制乳腺癌細胞存活和增殖，并能癌細胞的降低化療耐受性，促進體外凋亡[7]，提示miR-148a過表達或可影響腫瘤患者預后。本文結果顯示，miR-223<1.75、miR-148a≥1.0是影響骨肉瘤患者的預后獨立危險因素，miR-223、miR-148a與TNM分期、分化程度、遠處轉移等有關，提示miR-223、miR-148a或是通過調控腫瘤分化、轉移來影響患者預后。另外，本文結果還顯示，miR-223、miR-148a聯合檢測診斷骨肉瘤的AUC高于0.75，說明miR-223、miR-148a聯合檢測對骨肉瘤的早期診斷價值較高，但miR-223、miR-148a聯合檢測評估患者預后的AUC低于0.75，故而不建議通過檢測血清miR-223、miR-148a水平來評估骨肉瘤患者預后。

綜上所述，血清miR-223、miR-148a聯合檢測對骨肉瘤的診斷價值較高，且miR-223<1.75、miR-148a≥1.0是影響患者預后的危險因素。