苦瓜中皂苷、黃酮、多糖復合提取工藝研究*

蒲春宏，黃 榮

(成都師范學院化學與生命科學學院，功能分子結構優化與應用四川省高校重點實驗室，四川 成都 611130)

隨著人類生活水平提升，肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化等代謝相關疾病威脅著人類的健康，而現有藥物服用后的效果不佳，因此，開發天然、安全有效的食源性產品調節人體代謝有著極為重要的意義[1]。苦瓜，葫蘆科苦瓜屬，又名錦荔枝、賴葡萄、涼瓜等，是一年生攀援性草本植物，原產亞熱帶，分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區[2]。苦瓜的營養價值比較高，含有多種營養成分，是人們日常生活中的藥食兩用食品。苦瓜含有多糖、皂苷、黃酮、多肽、生物堿、維生素、氨基酸等多種天然生物活性成分以及豐富的鋅、鎂、鐵和鉻等微量元素[3-4]，近年來國內外學者研究發現，苦瓜及活性提取物具有降糖降脂、抗病毒、抗氧化、調節腸道菌群、增強免疫力等功能特性[5-6]。

現代研究表明，皂苷類、蒽醌類、蛋白質類、黃酮類、生物堿類、活性多糖類等多種活性成分具有良好的降糖降脂作用。苦瓜中含有豐富的皂苷、黃酮、多糖等活性成分[7-8]，具有較強的降血脂、降血糖的功效[9-10]，并且苦瓜皂苷聯合其他植物多糖或黃酮后具有更好的降糖降脂效果，聯合使用比單獨使用時的降糖降脂功效明顯增強，對肝腎的保護作用也加強，效果更加顯著，且黃酮類化合物具有抗癌防癌、提高免疫力、抗氧化、抗衰老等多種生物活性[11-13]。隨著相關研究的深入，苦瓜活性成分的降糖降脂的作用機制在近年來也有了更加全面的進展，因此人們將目光越來越多的聚集到苦瓜有效利用的研究上。

目前，苦瓜活性成分的提取大多是單一成分，至多為兩種成分的研究，從苦瓜中復合提取皂苷、黃酮和多糖工藝未見報道，傳統單一成分的提取工藝沒有充分利用原料，只提取出苦瓜中一種或兩種有效成分，對資源造成很大的浪費。因此，亟須研究出多種成分復合提取的工藝，以填補區域空白，合理有效地利用資源。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

苦瓜粉(過60目篩，烘至恒重)，乙醇，甲醇，乙酸，硫酸，香草醛，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，苯酚均為分析純級；人參皂苷Rg1、無水葡萄糖(HPLC>98%)，成都康邦生物科技有限公司；蘆丁(HPLC>98%)，成都普菲德生物技術有限公司。

1.2 主要儀器和設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； TG16.5高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司； XY-2000旋轉蒸發儀，上海翔雅儀器設備有限公司；LC-520冷卻液循環裝置，上海翔雅儀器設備有限公司；SHB-111循環水式真空泵，上海翔雅儀器設備有限公司。

2 苦瓜中連續提取皂苷、黃酮和多糖的方法

根據相似相溶原理，隨著皂苷、黃酮、多糖的極性逐漸增大，浸提溶劑的極性也應逐漸增大，選用乙醇/水作為提取工藝的浸提溶劑，乙醇的體積分數應逐漸減小[14]。本實驗選用95%～75%乙醇溶液提取皂苷，60%～40%乙醇溶液提取黃酮，10%～0%乙醇溶液提取多糖。并使用超聲波輔助提取，采用三因素三水平正交試驗對乙醇濃度、超聲時間、料液比進行條件優化，篩選出最優提取方案。

2.1 標準曲線繪制

2.1.1 皂苷標準曲線

準確稱取25 mg人參皂苷Rg1，加入適量的甲醇使其溶解后，后將其轉移定容至25 mL容量瓶中，制成1 mg·mL-1的人參皂苷標準溶液，準確吸取標準皂苷溶液0.75、105、135、165、195 μL于10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入新制5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和80%濃硫酸0.8 mL，密塞，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻10 min，加入5 mL冰乙酸稀釋，搖勻，靜置15 min后于549 nm處測定吸光度[15]，以吸光度為縱坐標，皂苷質量濃度為橫坐標，繪制吸光度-皂苷質量濃度標準曲線，得線性回歸方程式y=0.0381x-0.2085(R2=0.9995)。

2.1.2 黃酮標準曲線

準確稱取干燥后的蘆丁標準品25 mg，加入適量80%乙醇并在水浴鍋中邊加熱邊搖晃直至溶解，后將其轉移定容至 100 mL容量瓶，配制成0.25 mg·mL-1的標準試劑，分別精確吸取蘆丁標準試劑0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 25 mL容量瓶中，分別加入0.75 mL質量分數5%的NaNO2，搖勻，放置 5 min后加入0.75 mL質量分數10%的Al(NO3)3，6 min后再加入10 mL質量分數4 %的NaOH溶液，混勻，用80%乙醇稀釋至刻度，10 min后于波長510 nm處測定吸光度[16]。以吸光度為縱坐標，蘆丁質量濃度為橫坐標，繪制吸光度-蘆丁質量濃度標準曲線，得線性回歸方程式y=0.0124x+0.0404(R2=0.9999)。

2.1.3 多糖標準曲線

準確稱取10 mg葡萄糖標準品，加入適量超純水溶解，后轉移至100 mL容量瓶中定容，配成0.1 mg·mL-1標準液，分別精確吸取葡萄糖標準試劑0、0.05、0.15、0.25、0.35、 0.45 mL于10 mL具塞試管中，加水補至2 mL，加0.4 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加4.5 mL濃H2SO4，60 ℃水浴 10 min，冷卻至室溫，于493 nm處測定吸光度[17]。以吸光度為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制吸光度-葡萄糖質量濃度標準曲線，得線性回歸方程y=0.0452x+0.3431(R2=0.9991)。

2.2 提取率計算公式

式中：C——樣品濃度，mg·L-1；V——提取液的體積與稀釋倍數的乘積，L；W——稱取樣品苦瓜粉的質量，g。

2.3 從苦瓜中連續提取皂苷、黃酮和多糖的條件實驗

2.3.1 提取皂苷正交實驗

準確稱取3.0 g干燥的苦瓜粉，加入乙醇溶液，濃度為95%、80%、75%，料液比為1:25、1:20、1:15 g/mL， 60 ℃下超聲，超聲時間40 min、35 min、30 min。抽濾，將提取液減壓旋蒸回收乙醇，用甲醇將濃縮液定容至25 mL容量瓶中，測定含量，計算皂苷提取率，篩選最優提取條件，實驗設計因素水平表見表1。

表1 提取皂苷正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction of saponins

2.3.2 提取黃酮正交實驗

根據2.3.1最佳提取條件：乙醇濃度95%，料液比1: 20 g/mL，超聲時間30 min，提取皂苷后得濾渣1，將濾渣1干燥至恒重，準確稱取3.0 g，加入乙醇溶液，濃度為60%、50%、40%，料液比為1:25、1:20、1:15 g/mL，60 ℃下超聲，超聲時間35 min、30 min、25 min。抽濾，將提取液減壓旋蒸回收乙醇，用80%乙醇將濃縮液定容至100 mL容量瓶中，測定含量，計算黃酮提取率，篩選出最優提取條件，實驗設計因素水平表見表2。

表2 提取黃酮正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for extraction of flavonoids

2.3.3 提取多糖正交實驗

根據2.3.2最佳提取條件：乙醇濃度60%，超聲時間 35 min，料液比1:25 g/mL，提取黃酮后得濾渣2，將濾渣2干燥至恒重，準確稱取3.0 g，加入乙醇溶液，濃度為10%、5%、0%，料液比為1:25、1:20、1:15 g/mL，70℃下超聲，超聲時間30 min、25 min、20 min。超聲完后6000 r·min-1離心20 min，再進行抽濾，用水將濾液定容至100 mL容量瓶中，測定含量，計算多糖提取率，篩選出最優提取條件，實驗設計因素水平表見表3。

表3 提取多糖正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test for extraction of polysaccharides

2.4 從苦瓜中連續提取皂苷、黃酮和多糖的復合實驗

稱取10 g干燥的苦瓜粉，按優化的皂苷提取實驗條件，提取苦瓜皂苷，抽濾得濾渣1、濾液1，檢測濾液1中的皂苷含量。按優化的黃酮提取實驗條件，提取上一步濾渣1中的黃酮，抽濾得濾渣2、濾液2，檢測濾液2中的黃酮含量。按優化的多糖提取實驗條件，提取上一步濾渣2中的多糖，抽濾后得濾液3，檢測濾液3中的多糖含量，分別計算苦瓜皂苷、黃酮、多糖的提取率。

3 結果與分析

3.1 提取皂苷正交實驗結果

根據表1進行皂苷提取的正交實驗，實驗結果如表4所示。

表4 正交實驗設計方案及實驗結果Table 4 Design and results of orthogonal experiment for extraction of saponins

根據表4極差分析可知，三個因素影響苦瓜中皂苷的提取率程度不同，料液比影響最大，乙醇濃度影響較小，超聲時間影響最小。影響順序即是：C>A>B。同時，由正交實驗結果分析可得出，C2A1B3是提取苦瓜皂苷的最優提取工藝參數，即料液比1:20 g/mL，乙醇濃度95%，超聲時間30 min，此時苦瓜皂苷提取效果最佳。

3.2 提取黃酮正交實驗結果

根據表2進行黃酮提取的正交實驗，實驗結果如表5所示。

表5 正交實驗設計方案及實驗結果Table 5 Design and results of orthogonal experiment for extraction of flavonoids

根據表5極差分析可知，三個因素影響苦瓜中黃酮的提取率程度不同，乙醇濃度影響最大，料液比影響較小，超聲時間影響最小。影響順序即是：A>C>B。同時，由正交實驗結果分析可得出，A1C1B1是提取苦瓜黃酮的最優提取工藝參數，即乙醇濃度60%，料液比1:25 g/mL，超聲時間35 min，此時苦瓜黃酮提取效果最佳。

3.3 提取多糖正交實驗結果

根據表3進行多糖提取的正交實驗，實驗結果如表6所示。

表6 正交實驗設計方案及實驗結果Table 6 Design and results of orthogonal experiment for extraction of polysaccharides

續表6

根據表6極差分析可知，三個因素影響苦瓜中多糖的提取率程度不同，乙醇濃度影響最大，超聲時間影響較小，料液比影響最小。影響順序即是：A>B>C。同時，由正交實驗結果分析可得出，A3B1C3是提取苦瓜黃酮的最優提取工藝參數，即乙醇濃度0%(蒸餾水)，超聲時間30 min，料液比1:15 g/mL，此時苦瓜多糖提取效果最佳。

3.4 復合提取實驗結果

根據提取苦瓜皂苷、黃酮、多糖的正交實驗得到相應的最佳提取條件，提取皂苷：料液比1:20 g/mL，乙醇濃度95%，超聲時間30 min；提取黃酮：乙醇濃度60%，料液比 1:25 g/mL，超聲時間35 min；提取多糖：乙醇濃度0%(蒸餾水)，超聲時間30 min，料液比1:15 g/mL。取10 g苦瓜粉按最優條件進行連續提取，得皂苷提取率為2.76%、黃酮提取率為0.29%、多糖提取率為5.29%。

4 結 論

本實驗采用高、中、低體積分數的乙醇溶液作為提取溶劑，并使用超聲波輔助的方法，按照皂苷、黃酮、多糖的順序從苦瓜中連續提取出皂苷、黃酮和多糖，用正交實驗得到了復合提取工藝條件：料液比1:20 g/mL，乙醇濃度95 %，超聲時間30 min提取皂苷，皂苷提取率為2.76%；乙醇濃度60%，料液比1:25 g/mL，超聲時間35 min提取黃酮，黃酮提取率為0.29%；乙醇濃度0%(蒸餾水)，超聲時間30 min，料液比 1:15 g/mL提取多糖，多糖提取率為5.29%。

該復合提取工藝的提取溶劑僅使用乙醇溶液，提取液黏度小，易于過濾與分離，方便回收進行二次利用，綠色、環保無毒，符合現如今的綠色環保新發展理念。與傳統活性成分的浸提相比，利用超聲波的空化現象以及震動作用，加快了提取速度。并且本復合提取工藝流程簡便，易于實現工業化生產，同時僅從同一份苦瓜原料中，就可以提取出多種活性成分，原料得到了充分的利用，使得生產成本降低，有一定的參考價值，也可為苦瓜活性成分開發及深入研究提供參考。